Page 128 - 《精细化工》2023年第11期

·2440· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

续表 3
引物 序列（5′→3′）
p43NMK-F4 TTTACATTCCGTATCACAATAATAATGATGAAAGCTTGGCGT
p43NMK-R1 GAAGTGGCTGTCTGTCATAAAATAAACCTCCTTTCTTTTACTTACCC
p43NMK-R2 AATCGCCGTCCGATTCATAAAATAAACCTCCTTTCTTTTACTTACCC
p43NMK-R3 ATGTGTGGGGTAGCCATAAAATAAACCTCCTTTCTTTTACTTACCCTC
p43NMK-R4 AGCACCTATATGTACACTCATAAAATAAACCTCCTTTCTTTTACTTACCC
PNP-F1 AAAGAAAGGAGGTTTATTTTATGACAGACAGCCACTTCTCA
PNP-F2 AAAGAAAGGAGGTTTATTTTATGAATCGGACGGCGATT
PNP-F3 AAGAAAGGAGGTTTATTTTATGGCTACCCCACACATTAA
PNP-F4 GAAAGGAGGTTTATTTTATGAGTGTACATATAGGTGCTGA
PNP-R1 AGCTTTCATCATTACGCCAGCTTTCGTAAAAAG
PNP-R2 TTTCATCATTAGTTTTTCGCCATATTTCTGACAAT
PNP-R3 AAGCTTTCATCATTATTACTCTTTATCGCCCAGCAG
PNP-R4 ACGCCAAGCTTTCATCATTATTATTGTGATACGGAATGTAAAGCCA

1.2.2 全细胞催化实验 继续加入 300 mmol/L 的磷酸钠缓冲液（pH 7.0），
将表 1 中本实验自行构建的重组菌株涂布于 LB 使催化反应体系总量为 100 mL。随后，将全细胞催
固体培养基上，37 ℃培养 12 h，得到重组菌株单菌 化体系分别置于 35、40、45、50、55、60 ℃下，
落。取形态较大、呈椭圆形的重组菌株单菌落接种于 转速 200 r/min 下恒温搅拌 2 h 后，用 HPLC 检测 dA
20 mL 种子培养基中，30 ℃、250 r/min 培养 24 h， 的含量以确定最适反应温度。
然后将上述种子培养液以体积分数 10%的接种量接 1.2.4 dA 含量及脱氧胸苷转化率测定
至 50 mL 发酵培养基中，30 ℃、250 r/min 培养 72 h。 用高效液相色谱仪（HPLC）对脱氧胸苷及 dA
将发酵液经冷冻离心机进行低温高速离心（4 ℃， 进行定量分析，采用外标法，根据 HPLC 谱图中脱
10000 r/min，10 min）以收集细胞，–20 ℃冷冻备用。 氧胸苷和 dA 的峰面积计算催化反应液中脱氧胸苷
催化体系：在 100 mL 反应瓶中，底物脱氧胸苷 和 dA 的含量 [25] 。催化反应结束后，取 1 mL 反应液
20 g（82.57 mmol）和腺嘌呤 11.16 g（82.57 mmol） 进行低温高速离心（4 ℃，10000 r/min，10 min）
以 n（脱氧胸苷）∶n（腺嘌呤）=1∶1 投入至 300 mmol/L 沉淀细胞，上清液经 0.25 µm 滤膜过滤，用去离子
的磷酸钠缓冲液（pH=7.0）中（反应体系总量为 水稀释 100 倍后作为待测样品，对反应液中的脱氧
100 mL），加入质量浓度（以催化反应体系体积计， 胸苷和 dA 进行 HPLC 检测。测试条件为色谱柱：
下同）为 100 g/L 的细胞，温度 40 ℃，转速 200 r/min Inertsil ODS-3 (150 mm×4.6 mm×5 µm)；检测波长
下恒温搅拌 2 h。 254 nm；柱温 30 ℃；流速 1.0 mL/min；进样量 5 µL；
1.2.3 全细胞催化条件的优化 流动相 A：20 mmol/L 磷酸二氢铵水溶液；流动相
细胞添加质量浓度的优化：在 100 mL 反应瓶 B：甲醇，线性梯度洗脱。并按下式计算脱氧胸苷
中，将底物脱氧胸苷 20 g（82.57 mmol）和腺嘌呤 的转化率：
11.16 g（82.57 mmol）以 n（脱氧胸苷）∶n（腺嘌呤）= 转化率 /%  ( /cc 2 ) 100 （1）
1
1∶1 投入至 50 mL 磷酸钠缓冲液（300 mmol/L， 式中：c 1 为催化反应后反应液中 dA 的浓度，mol/L；
pH 7.0）中，加入质量浓度分别为 50、100、150、 c 2 为催化反应体系中脱氧胸苷的起始浓度，mol/L。
200、250 g/L 的细胞，充分搅拌后，继续加入
300 mmol/L 的磷酸钠缓冲液（pH 7.0），使催化反应 2 结果与讨论
体系总量为 100 mL。随后，在温度 40 ℃，转速 2.1 核苷磷酸化酶的组合表达及 RBS 优化
200 r/min 条件下恒温搅拌 2 h 后，用 HPLC 检测 dA 脱氧胸苷作为核糖基供体，需经过嘧啶核苷磷
的含量以确定最适细胞添加质量浓度。 酸化酶（PyNP）脱去胸腺嘧啶基团，并在嘌呤核苷
催化反应温度的优化：在 100 mL 反应瓶中， 磷酸化酶（PNP）的作用下，以腺嘌呤为碱基供体，
将底物脱氧胸苷 20 g（82.57 mmol）和腺嘌呤 11.16 g 催化合成 dA，因此，dA 的合成需要 PyNP 与 PNP
（82.57 mmol）以 n（脱氧胸苷）∶n（腺嘌呤）= 1∶1 的共同作用 [20-24] 。
投入至 50 mL 磷酸钠缓冲液（300 mmol/L，pH 7.0） 不同宿主来源的核苷磷酸化酶其催化活性与特
中，加入质量浓度为 150 g/L 的细胞，充分搅拌后， 异性存在显著差异，因此，通过表达不同宿主来源