Page 129 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 陈 伟，等: 重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成 2′-脱氧腺苷 ·2441·

的核苷磷酸化酶以确定最适的组合。基于 B. subtilis （来源于 E. coli，Gene ID: 945654）、PNP4（来源
168 基因组数据查阅，发现其具有内源性的 PNP 于 B. subtilis）的表达，获得重组质粒 p43NMK1、
（由基因 deoD 编码，Gene ID: 940038）。为了保 p43NMK2、p43NMK3 和 p43NMK4（图 1a）。将重
证实验变量的唯一性，首先利用表达敲除框对基因 组质粒 pHT 系列与 p43NMK 系列两两随机组合表
deoD 进行敲除，获得菌株 BS0。其次，选择 pHT 达，获得了重组菌株 CW1~CW8。然后，将这 8 株
质粒作为表达载体，利用组成型启动子 P veg 分别控 重组菌株进行全细胞催化合成 dA，以验证不同宿
制异源酶 PyNP1 （来源于 E. coli ， Thymidine 主来源的核苷磷酸化酶组合表达时 dA 的合成情
phosphorylase，Gene ID: 948901）、PyNP2（来源于 况，结果如图 1b 所示。
B. stearothermophilus TH6-2，UniProtKB Sequence 由图 1b 可以看出，8 株重组菌株均能够转化脱
ID: P77836.1）的表达，获得重组质粒 pHT1 和 pHT2。 氧胸苷和腺嘌呤生成 dA。然而，PyNP1 表达酶的 4
之后，选择 p43NMK 质粒作为表达载体，利用组成 株重组菌株其产量与转化率均明显高于 PyNP2 表达
型启动子 P 43 分别控制 PNP1（来源于 Citrobacter 酶的重组菌株。其中，CW3 菌株的 dA 产量最高，
amalonaticus ATCC25405 ， NCBI Sequence ID: 为 113.1 g/L，脱氧胸苷转化率为 54.5%。结果表明，
BCU49562.1）、PNP2（来源于 B. stearothermophilus 不同的核苷磷酸化酶组合表达能够显著影响 dA 的
TH6-2，UniProtKB Sequence ID: P77834.1）、PNP3 全细胞催化合成效果。

a—核苷磷酸化酶表达载体构建示意图；b—不同核苷磷酸化酶组合表达条件下 dA 的产量及脱氧胸苷转化率；pHT 中的 1 为来源于
E. coli 的 PyNP1 酶；pHT 中的 2 为来源于 B. stearothermophilus TH6-2 的 PyNP2 酶；p43NMK 中的 1 为来源于 Citrobacter amalonaticus
ATCC25405 的 PNP1 酶；p43NMK 中的 2 为来源于 B. stearothermophilus TH6-2 的 PNP2 酶；p43NMK 中的 3 为来源于 E. coli 的 PNP3
酶；p43NMK 中的 4 为来源于 B. subtilis 的 PNP4 酶
图 1 不同来源的核苷磷酸化酶组合表达对 dA 产量及脱氧胸苷转化率的影响
Fig. 1 Effect of nucleoside phosphorylase combination expression from different sources on dA production and deoxythymidine
conversion rate

为了进一步提高 dA 的产量及脱氧胸苷转化率，
对 CW3 菌株内的核苷磷酸化酶表达框中的 RBS 序
列进行优化。使用 RBS calculator 分别设计酶 PyNP1
与 PNP3 的最优 RBS 序列，获得了理论最优 RBS
序列 RBS opPyNP （对应酶 PyNP1）：CCGGGGAAAA
CTACCCCCGCGAACGAAAAGGAGGTTTTATTT 与
RBS opPNP （对应酶 PNP3）：CGAAATTTTCTATCACG
AGACCAGGAGGTATTTT。将pHT1质粒与p43NMK3
质粒上的原始 RBS 序列分别替换为 RBS opPyNP 和
RBS opPNP ，获得重组质粒 pHT1-1 与 p43NMK3-1，
并分别验证 RBS 序列优化对 dA 产量的影响，结果
如图 2 所示。 “–”代表重组菌株未使用优化 RBS 序列；“+”代表重组菌株
使用优化 RBS opPyNP /RBS opPNP 序列
由图 2 可以看出，单独优化 PyNP1（菌株
图 2 优化 RBS 序列对 dA 产量及脱氧胸苷转化率的影响
CW3-1）或 PNP3（菌株 CW3-2）的重组菌株合成
Fig. 2 Effect of optimizing RBS sequence on dA production
dA 的能力均有明显提高。 and deoxythymidine conversion rate