Page 124 - 《精细化工》2023年第11期

第 40 卷第 11 期 精 细 化 工 Vol.40, No.11
2 023 年 11 月 FINE CHEMICALS Nov. 2023

生物工程
重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成 2′-脱氧腺苷

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陈 伟 ，陈令伟 ，李文超 ，郑玲辉
（1. 杭州珲益生物科技有限公司，浙江 杭州 310011；2. 天津科技大学 生物工程学院，天津 300457）
摘要：以枯草芽孢杆菌 168（简写为 BS）为宿主，以脱氧胸苷和腺嘌呤为底物，异源表达组合来源于大肠杆菌
（E. coli）的嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP）与嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）作为催化酶源，全细胞催化合成 2′-脱氧
腺苷（dA）。首先，以 BS 敲除内源性的 PNP（由基因 deoD 编码，Gene ID: 940038）后的菌株 BS0 为出发菌株，
经过 PyNP1 酶（来源于 E. coli，Gene ID: 948901）与 PNP3 酶（来源于 E. coli，Gene ID: 945654）的重组表达
得到 CW3，再优化 PyNP1 与 PNP3 的对核糖体结合位点（RBS）序列得到重组菌株 CW3-3，在 CW3-3 作用下，
dA 的产量为 133.4 g/L，脱氧胸苷的转化率为 64.3%；其次，以 CW3-3 为出发菌株，利用互作短肽构建自组装
多酶复合物，经过 PyNP1 酶 N 端融合 RIAD，PNP3 酶 C 端融合 RIDD（其中 RIAD 和 RIDD 为互作短肽标
签）处理后，PyNP1 酶 N 端融合 4 个 RIAD 标签得到重组菌株 CW17，在其作用下，dA 的产量达到 179.6 g/L，
显著提升了底物转化率；最后，对重组菌株 CW17 全细胞催化条件细胞添加质量浓度及催化反应温度进行了优
化，在细胞添加质量浓度为 150 g/L，反应温度 50 ℃条件下，dA 的产量达到 200.3 g/L，脱氧胸苷的转化率为
96.6%。
关键词：2′-脱氧腺苷；嘧啶核苷磷酸化酶；嘌呤核苷磷酸化酶；互作短肽；枯草芽孢杆菌；全细胞催化；生物
工程
中图分类号：TQ460.1；TQ426.97 文献标识码：A 文章编号：1003-5214 (2023) 11-2436-09

Highly efficient production of 2′-deoxyadenosine by whole-cell

catalysis of engineered Bacillus subtilis

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CHEN Wei , CHEN Lingwei , LI Wenchao , ZHENG Linghui
（1. Hangzhou Hizyme Biotech Co., Ltd., Hangzhou 310011, Zhejiang, China; 2. College of Biotechnology, Tianjin
University of Science and Technology, Tianjin 300457, Tianjin, China）
Abstract: 2′-Deoxyadenosine (dA) was synthesized from the whole cell of Bacillus subtilis 168 (BS for
short), which were catalyzed by the heterologous enzymes of pyrimidine nucleoside phosphorylase (PyNP)
and purine nucleoside phosphorylase (PNP) from Escherichia coli, using deoxythymidine and adenine as
substrate. The recombinant B. subtilis CW3-3, which was obtained from recombinant expression of PyNP1
enzyme (from E. coli, Gene ID: 948901) and PNP3 enzyme (from E. coli, Gene ID: 945654) and
optimization of the ribosome binding site (RBS) for PyNP1 and PNP3 enzyme using BS0 strain (BS strain
knocked out of endogenous PNP and encoded by Gene deoD, Gene ID: 940038) as starting strain, exhibited
a yield of dA 133.4 g/L and a conversion rate of deoxythymidine 64.3%. Moreover, B. subtilis CW3-3 was
further used as starting strain to construct a self-assembled multi-enzyme complex with interacting short
peptides. After treatment with N-terminal fusion RIAD of PyNP1 enzyme and C-terminal fusion RIDD of
PNP3 enzyme (RIAD and RIDD are interacting short peptide labels), the N-terminal fusion of PyNP1
enzyme fused with four RIAD labels to obtain recombinant strain B. subtilis CW17, which improved the
yield of dA to 179.6 g/L. Finally, the cell addition mass concentration and catalytic reaction temperature
conditions of the recombinant B. subtilis CW17 whole-cell catalysis were optimized and further boosted the

收稿日期：2023-02-23; 定用日期：2023-05-19; DOI: 10.13550/j.jxhg.20230127
基金项目：天津市教委科研计划项目（2019KJ237）
作者简介：陈 伟（1989—），男，博士，E-mail：doctor.chen1989@foxmail.com。联系人：郑玲辉（1978—），男，硕士，E-mail：
zhenglinghui@huidabiotech.com。