Page 125 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 陈 伟，等: 重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成 2′-脱氧腺苷 ·2437·

production of dA to 200.3 g/L and the conversion rate of deoxythymidine to 96.6%.
Key words: 2′-deoxyadenosine; pyrimidine nucleoside phosphorylase; purine nucleoside phosphorylase;
interacting short peptide; Bacillus subtilis; whole-cell catalysis; bioengineering

2′-脱氧腺苷（dA）是脱氧核糖核酸（DNA）的 源细胞，重复催化 10 次后脱氧胸苷的转化率仍达
结构组成物质 [1-3] ，其被广泛应用于人工合成寡聚核 32%。生物酶催化法不仅可以满足 dA 市场的增长需
苷酸等领域，是基因工程药物研究领域的重要原材 求，而且绿色环保，是解决资源可持续化问题的最
料 [4-7] 。此外，对 dA 的碱基或脱氧核糖进行修饰获 佳途径之一 [22-28] 。但生物酶法依然存在底物浓度低，
得的核苷类衍生物不仅可以直接促进生物体内蛋白质 dA 生产成本偏高，进而导致其大规模应用受限等问
与核酸的代谢合成 [8-11] ，而且可以作为化学中间体用 题 [21-26] 。王建琨 [20] 利用大肠杆菌游离细胞进行生物
于抗病毒、抗肿瘤及抗艾滋病等药物的合成 [4-7,10-13] 。 转化合成 dA，当反应底物脱氧胸苷质量浓度为 13
当前，dA 的制备主要有脱氧核糖核酸降解法 [14] 、 g/L 时，脱氧胸苷转化率为 56.2%，底物质量浓度及
化学合成法 [15-19] 和生物酶催化法 [20-27] 。脱氧核糖核 底物转化率均较低。此外，LIANG 等 [26] 在 E. coli
酸降解法中底物脱氧核糖核酸稳定性较差，容易在 内过表达内源性的核苷磷酸化酶实现了 dA 的催化
制备过程中产生大量副产物，收率较低 [14] 。化学合 合成，虽然腺嘌呤的转化率可达 96%，但最终得到
成法则因制备成本高、环境不友好等无法满足当前 的 dA 质量浓度仅为 14.4 g/L，无法满足工业化生产
市场需求 [15,17-19] 。相比于以上两种制备方法，生物 需求。
酶催化法则可利用具有高核苷磷酸化酶活性的细胞 针对生物酶法存在的问题，本文以枯草芽孢杆
作为催化酶源，以脱氧胸苷及腺嘌呤作为反应底物 菌（Bacillus subtilis 168）为宿主，异源表达并组合
实现 dA 的合成 [22-25] 。LIANG 等 [26] 在大肠杆菌 优化不同来源的嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP）与嘌呤
Escherichia coli BL21 内过表达内源性的核苷磷酸 核苷磷酸化酶（PNP）以实现 dA 的全细胞催化合成
化酶，可实现 dA 的高效催化合成，腺嘌呤的转化 （反应路线如下所示），为 dA 的生产提供一种绿色
率可达 96%。刘国生等 [25] 利用聚丙烯酰胺固定化酶 高效的催化合成工艺。

水），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酵母
1 实验部分
粉（YP600）、酵母抽提粉（FM808）、酵母膏
1.1 材料、试剂与仪器 （ LM800 ） ，安琪 酵母 股份有 限公 司；蛋 白胨
（Y001A），北京鸿润宝顺科技有限公司；琼脂粉
所用菌株如表 1 所示。
Prime STAR DNA 聚合酶，生物试剂，宝生物 （A8190），北京索莱宝科技有限公司；除特别说
明，其他常规试剂均为国药分析纯。
工程（大连）有限公司；Taq DNA 聚合酶，生物试
剂，南京诺唯赞生物科技有限公司；氯霉素（美国 LB 培养基（均为质量浓度，下同）：蛋白胨
药典级，色谱含量为 97%~103%）、氨苄青霉素（钠 10 g/L、酵母粉 5 g/L、氯化钠 10 g/L，固体培养基
盐，美国药典级，含量为 845~988 mg/g）、卡那霉 额外添加质量分数为 2%的琼脂粉。
素（硫酸盐，美国药典级，含量≥750 mg/g）、质 种子培养基：葡萄糖 30 g/L、蛋白胨 10 g/L、
粒提取试剂盒（生物试剂），生工生物工程（大连） 酵母膏 10 g/L、酵母抽提粉 5 g/L、氯化钙 2 g/L、
股份有限公司；博莱霉素（生物试剂，质量浓度为 硫酸镁 2 g/L、磷酸二氢钾 5 g/L，灭菌前用质量分
100 g/L）、DNA 片段回收试剂盒（生物试剂），美 数为 30%的氢氧化钠溶水液调节 pH 至 7.0。
国赛默飞世尔科技有限公司；无缝克隆试剂盒，生 发酵培养基：葡萄糖 30 g/L、酵母膏 10 g/L、
物试剂，上海碧云天生物科技有限公司；脱氧胸苷 酵母抽提粉 10 g/L、吐温-80 6 g/L、柠檬酸铵 4 g/L、
（2′-脱氧胸苷，医药级，HPLC 含量≥99%），芜 硫酸镁 3 g/L、磷酸二氢钾 6 g/L、氯化钾 3 g/L、氯
湖华仁科技有限公司；腺嘌呤（医药级，HPLC 含 化钙 3 g/L，灭菌前用质量分数为 30%的氢氧化钠水
量≥99%），北京百灵威科技有限公司；葡萄糖（无 溶液调节 pH 至 6.0。