Page 127 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 陈 伟，等: 重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成 2′-脱氧腺苷 ·2439·

表 2 实验中所用质粒的特征与来源
Table 2 Characteristics and origin of plasmids used in the experiment
质粒 特征 来源
r
r
pHT ColE1, Amp , Cm , RepA, E. coli-B. subtilis 穿梭质粒, ΔP veg::egfp 实验室保藏
r
r
p43NMK ColE1, Amp , RepB, Kan , E. coli-B. subtilis 穿梭质粒, ΔP 43::egfp 实验室保藏
pHT-P veg-PyNP 系列 pHT 衍生质粒，P veg 表达不同来源的 PyNP 基因 本实验构建
p43NMK-P 43-PNP 系列 p43NMK 衍生质粒，P 43 表达不同来源的 PNP 基因 本实验构建
pHT-P veg-PDZ/RIAD/CCDIA-PyNP 系列 pHT-P veg-PyNP 系列衍生质粒，PyNP 酶 N 端融合 PDZ/RIAD/CCDIA 本实验构建
短肽标签
p43NMK-P 43-PNP-PDZ lig/RIDD/CCDIB p43NMK-P 43-PNP 系列衍生质粒，PNP 酶 C 端融合 PDZ lig/RIDD/ 本实验构建
系列 CCDIB 短肽标签
r
注：以 p43NMK 质粒为例，ColE1 为 E. coli 复制子，Amp 表示该质粒在 E. coli 中表现为氨苄抗性，RepA 和 RepB 为 B. subtilis 复制子，Kan r
表示该质粒在 B. subtilis 中表现为卡那抗性，ΔP 43::egfp 表示敲除该质粒上的 P 43 启动子区域，插入增强型绿色荧光蛋白 egfp 基因片段。

表达敲除框的构建：利用 Cre/loxp 重组酶系统 Linker 将单个 RIDD 序列融合至 PNP 酶的 C 端，构
进行基因组编辑 [29] 。以敲除 PNP 酶的编码基因 建 p43NMK-P 43 -PNP-RIDD 质粒。最后，将
deoD 为例，首先利用引物 deoD-U-F、deoD-U-R pHT-P veg -RIAD-PyNP 与 p43NMK-P 43 -PNP-RIDD 质
从 B. subtilis 168 基因组中扩增出上游同源臂 粒依次转入 BS0 的感受态细胞。调控多酶复合物的
deoD-U，利用引物 deoD-D-F、deoD-D-R 从 B. 催化亚基比例时，在 pHT-P veg -RIAD-PyNP 质粒的
subtilis 168 基因组中扩增出下游同源臂 deoD-D； RIAD 序列 N 端继续融合多个 RIAD 序列，或在
其次，在上下游同源臂之间融合添加相应的抗性标 p43NMK-P 43 -PNP-RIDD 质粒的 RIDD 序列 C 端融合
签基因与 loxp 位点，最终获得 deoD 基因的表达敲 多个 RIDD 序列，多个重复 RIAD 或 RIDD 序列之
除框。 间无需添加 linker。
多酶复合物的构建：选择 3 种互作短肽（PDZ RBS 序列优 化：使用 RBS 预测网 站 “RBS
与 PDZ lig、RIAD 与 RIDD、CCDIA 与 CCDIB）进 calculator”(https: //salislab.net/software/predict_rbs_
行多酶复合物的构建。以构建基于 RIAD-RIDD 互 calculator)设计 PyNP1 与 PNP3 基因相对应的最优
作短肽的多酶复合物为例，利用(GGGGS) 3（代表 3 RBS 序列 RBS opPyNP 与 RBS opPNP 。
段重复的 GGGGS 氨基酸序列）作为 Linker，将单 引物设计与合成：引物由 SnapGene 进行设计，
个 RIAD 序列融合至 PyNP 酶的 N 端，构建 序列的合成与测序验证由安升达苏州实验室完成。
pHT-P veg -RIAD-PyNP 质粒。其次，利用(GGGGS) 3 本文所用引物的名称和序列如表 3 所示。

表 3 实验中所用引物的名称和序列
Table 3 Name and sequence of primers used in the experiment
引物 序列（5′→3′）
deoD-U-F TTAAATTTTCTTCACTTTTTCAAAGTACTCTT
deoD-U-R AGATTTACAGGAGGATATGAGATGATAAAATATATCAAGAGGCGTGC
deoD-D-F TGATATATTTTATCATCTCATATCCTCCTGTAAATCTAAATT
deoD-D-R TTTTTAGTGAAACATCTCCCGTTTT
pHT-F1 TACCGGCGAATATCTGAGTAACTGCAGGTCGACGTCCC
pHT-F2 TATATGATAAGATCTCGTAACTGCAGGTCGACGTCC
pHT-R1 CTCTTGCGCTAAAAACATAAAATAAACCTCCTTTCTTTTACTTA
pHT-R2 TCAAATCTACCATACGCATAAAATAAACCTCCTTTCTTTTACTTACC
PyNP1-F1 TAAGTAAAAGAAAGGAGGTTTATTTTATGTTTTTAGCGCAAGAGATT
PyNP1-F2 AAAAGAAAGGAGGTTTATTTTATGCGTATGGTAGATTTGATAGAGAA
PyNP1-R1 GGGGACGTCGACCTGCAGTTACTCAGATATTCGCCGGTATAC
PyNP1-R2 GGACGTCGACCTGCAGTTACGAGATCTTATCATATATTAGAGTCGGTG
p43NMK-F1 CTTTTTACGAAAGCTGGCGTAATGATGAAAGCTTGGCGTAATCA
p43NMK-F2 GTCAGAAATATGGCGAAAAACTAATGATGAAAGCTTGGCGT
p43NMK-F3 CCGTTCTGCTGGGCGATAAAGAGTAATAATGATGAAAGCTTGGCGTAA