Page 130 - 《精细化工》2023年第11期

·2442· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

菌株 CW3-1 的脱氧胸苷转化率为 61.6%，dA 产 进行构建表达，如图 3a 所示，分别将 RIAD、CCDIA
量为 127.8 g/L，比菌株 CW3 产量（113.1 g/L）提高 与 PDZ 标签融合至酶 PyNP1 的 N 端，将 RIDD、
了 13.0%。由于单独优化酶 PyNP1 或 PNP3 的 RBS CCDIB、PDZ-lig 融合至 PNP3 的 C 端。
序列时，dA 产量均有所改善，因此，将酶 PyNP1 和 将含有自组装多肽标签的重组菌株进行催化合成
PNP3 的 RBS 序列组合优化以验证其对 dA 产量和脱 dA，结果如图 3b 所示。从图 3b 可以看出，含有 PDZ-
氧胸苷转化率的影响，菌株 CW3-3 的 dA 产量继续 PDZ lig 的重组菌株 CW9 的 dA 产量降至 106.5 g/L，
提升，达到133.4 g/L，比菌株CW3产量提升了17.9%， 脱氧胸苷转化率 51.3%，与单独表达 PDZ-PyNP1 的
脱氧胸苷转化率为 64.3%。结果表明，通过优化表达 重组菌株 dA 合成能力类似，推测原因是 PDZ 标签
框的 RBS 序列，提高起始翻译速率，能够实现目标 融合至 PyNP1 酶的 N 端后，影响了 PyNP1 酶自身
酶 PyNP1 和 PNP3 的高效表达，最终提高 dA 的产量。 的催化活性，从而导致 dA 产量降低。与菌株 CW9
2.2 构建自组装多酶复合物提升催化效率 相反，重组菌株 CW10 与 CW11 的 dA 产量均有明
目前，利用互作短肽标签，构建空间上组织有 显提高，其中菌株 CW10 的 dA 产量达到 156.7 g/L，
序的多酶复合物能够有效改善多酶连续催化反应的 比 CW3-3 菌株（133.4 g/L）提升了 17.5%。此外，
整体效率 [30-31] 。本文拟利用互作短肽标签，将酶 单独表达 RIAD-PyNP1 或 PNP3-RIDD 的菌株其 dA
PyNP1 与 PNP3 在胞内形成自组装多酶复合物，进 产量与 CW3-3 菌株相比并未出现明显变化，该结果
一步提高 dA 的产量。选择 3 对不同的互作短肽标 佐证了菌株 CW10 的 dA 产量提升是因为胞内
签（RIAD-RIDD、CCDIA-CCDIB、PDZ-PDZ lig） PyNP1-PNP3 多酶复合物的成功构建。

a—多酶复合体构建及工作原理示意图；b—不同多酶复合体对 dA 产量及脱氧胸苷转化率的影响；“–”代表酶的 N/C 端未融合互作短肽；
PDZ/RIAD/CCDIA 代表在酶的 N 端融合了响应的互作短肽标签；PDZ lig/RIDD/CCDIB 代表在酶的 C 端融合了响应的互作短肽标签
图 3 构建多酶复合体对 dA 的产量及脱氧胸苷转化率的影响
Fig. 3 Effect of multi-enzyme complex construction on dA production and deoxythymidine conversion rate

此外，RIAD-RIDD 互作短肽标签可通过调节其
催化亚基比例，调控多酶复合物体系内多个酶的化
学计量比，从而进一步提高整体的催化效率。以菌
株 CW10 为改造宿主，通过增加 RIAD 或 RIDD 标
签的串联拷贝数实现 PyNP1-PNP3 多酶复合物的计
量比调控，并对改造获得后的重组菌株 CW12~
CW18 进行 dA 合成，结果如图 4 所示。
由图 4 可以看出，当单独增加 RIDD 标签的串联
拷贝数时，多酶复合物中的 PyNP1 酶数量增多，dA
产量略微升高，菌株 CW13 的 dA 产量达到 164.5 g/L。
而单独增加 RIAD 标签的串联拷贝数时，dA 产量均有
“+”的个数代表酶的 N/C 端融合的互作短肽数量
明显提升。当 PyNP1 酶的 N 端融合 4 个 RIAD 标签 图 4 调节化学计量比对 dA 产量及脱氧胸苷转化率的影响
时，得到重组菌株 CW17，此时 dA 产量达到 179.6 g/L， Fig. 4 Effect of adjusted stoichiometric ratio on dA
与菌株 CW10（156.7 g/L）相比提升了 14.6%。 production and deoxythymidine conversion rate