Page 135 - 《精细化工》2023年第11期
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第 11 期           高亚惠，等:  芽孢杆菌 ZYCHH-01 发酵液提取物的抗菌抗氧化性能评价及应用                              ·2447·


            公司；UH5300 型紫外-可见分光光度计，日本日立                         指示细菌培养液在 3000 r/min 下离心 10 min 后，倒
            有限公司；SDC-100 型接触角测定仪，东莞市晟鼎                         出上清液，用无菌水反复洗涤、涡旋并离心 3 次，
                                                                                             8
            精密仪器有限公司；IMJ-78A 型高压灭菌锅，施都                         用无菌水稀释制成菌浓度为 1×10 CFU/mL 的细菌
            凯仪器设备（上海）有限公司；J-2.5FS 型均质机，                        分散液，待用；其次，用生理盐水配制质量浓度分
            广州聚能纳米生物科技股份有限公司。                                  别为 0.25、0.50、1、2、4、8、16 g/L 的冻干提取
            1.2   方法                                           物溶液和苯氧乙醇溶液，并用 0.22  μm 微孔滤膜过
            1.2.1   芽孢杆菌 ZYCHH-01 发酵液提取物的制备                    滤。最后，取 100  μL 样品溶液至 96 孔板中，再分
                 参照韩旭东等      [17] 的提取方法，以最大抑菌圈为                别加入 100  μL 细菌分散液至每个孔中，在 600 nm
            最佳提取工艺。首先，将芽孢杆菌 ZYCHH-01 按接                        下测定溶液的吸光值（OD 600 ）；将微孔板在 37  ℃
            种量（体积分数）0.1%接种至 10 mL 牛肉膏蛋白胨                       下培养 24 h，再次进行 OD 600 测试，以细菌分散液
            液体培养基中，在 37  ℃、150 r/min 条件下培养 24 h；               为阳性对照品，生理盐水为阴性对照品；以完全抑
            其次，将菌液按接种量（体积分数）3%接种至 200 mL                       制细菌生长的最低提取物质量浓度记为 MIC，实验
            新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在 36  ℃、190 r/min                   重复测定 3 次取平均值。
            条件下培养 27.5 h；最后，将发酵液在 4  ℃、10000 r/min             1.2.5   提取物对致病菌菌体形态的测定
            下离心 30 min。取上清液，经 0.22  μm 微孔滤膜过                       将 10 μL 指示菌株移至 10 mL 液体培养基中培
            滤后，用 6 mol/L 盐酸调节 pH 至 2.0，放入 4  ℃冰                养 12 h 后，在指示菌液中加入 1 mL 提取液，继续
            箱，沉淀 12 h，在 8000 r/min、4  ℃下离心处理 10 min。           培养 15 h 后，于 4  ℃、8000 r/min 离心 10 min，取
            收集沉淀，在–40  ℃下冷冻干燥 3 d，得到约 0.24 g                   沉淀，加入 20 mL 质量分数为 2.5%的戊二醛溶液，
            冻干的芽孢杆菌 ZYCHH-01 发酵液提取物（简称冻                        在 4  ℃下固定 12 h，然后在 4  ℃、5000 r/min 条件
            干提取物）。                                             下离心 10 min，除去戊二醛溶液，用 10 mL 去离子
                 使用时，将冻干提取物用 10 mL 生理盐水复溶              [18] ，  水洗涤沉淀物 3 次，依次加入 8 mL 不同体积分数的
            超声（300 W，超声 15 min）分散均匀后，经 0.22 μm                 乙醇水溶液（分别为 30%、50%、80%、95%、100%）
            水系混合纤维素（MCE）微孔滤膜过滤得到提取液，                           将细菌脱水后，在–40  ℃下冷冻干燥 2 d，喷涂金层
            通过干燥法      [19] 计算其固含量为 0.58%。                     100 s，用扫描电子显微镜（SEM）进行形貌观察                 [23] 。
            1.2.2   提取物的 GC-MS 分析                              1.2.6   提取物的体外抗氧化活性测定
                 为初步探究冻干提取物中的组分，将得到的冻                             （1）DPPH 自由基清除能力测定
            干提取物用 10 mL 甲醇溶解后进行 GC-MS 分析。                          采用吴颖等     [24] 的方法稍作修改。首先配制待测
            GC-MS 检测条件如下：色谱柱为 DB-5MS（30 m×                     溶液，将冻干提取物加入生理盐水中超声（300 W
            0.25 mm×0.25 μm）；升温程序为柱温40  ℃保持2 min，              超声 15 min）分散均匀后过 0.22  μm 微孔滤膜，得
            以 10  ℃/min 升至 300  ℃；载气为氦气，柱流速为                   到质量浓度分别为 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L
            1 mL/min，进样温度为 250  ℃，进样方式为不分流                     的溶液；然后，配制浓度为 0.2 mmol/L 的 DPPH-
            进样；MS 测试时，离子源为 EI 源，接口温度为 280  ℃，                  乙醇溶液。在测定管中加入 2 mL 待测溶液和 2 mL
            离子源温度为 220  ℃，扫描范围为 45~500 m/Z。                    DPPH-乙醇溶液，在对照管中加入 2 mL 待测溶液和
            1.2.3   提取物的抑菌活性测试                                 2 mL 无水乙醇，在空白管中加入 2 mL DPPH-乙醇
                 采用牛津杯扩散法        [20] 进行提取物的抑菌活性测              溶液和 2 mL 无水乙醇，摇匀后在室温下避光静置
            定。将指示菌株（E. coli、S. aureus、L. monocytogenes、        30 min，于 517 nm 处测定溶液的吸光度，测定时用
            Shigella、P. aeruginosa、S. typhimurium）在 150 r/min、  无水乙醇进行调零。以 Vc 为对照测定 DPPH 自由
            37  ℃条件下培养 24 h，用生理盐水稀释至菌浓度约                       基清除率。DPPH 自由基清除率按式（1）计算：
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            为 1×10 CFU/mL。取 100  μL 稀释后的指示菌液均                      自由基清除率      /% [1 (A    1   A 2 ) / A 0 ] 100    （1）
            匀涂布于固体培养基中，然后将灭菌的牛津杯（内                             式中：A 1 为测定管中溶液的吸光度；A 2 为对照管中
            径 6 mm，外径 8 mm）置于固体培养基中，并在牛                        溶液的吸光度；A 0 为空白管中溶液的吸光度。
            津杯中加入 100 μL 提取液，4  ℃静置 4 h 后，于 37  ℃                 （2）ABTS 自由基清除能力的测定
            恒温培养箱中培养 12 h，测量并记录抑菌圈直径的                              首先，按上述方法配制质量浓度分别为 0.1、
                                                        +
            大小  [21] 。以质量浓度为 1 g/L 的氨苄青霉素（A ）                  0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L 的待测溶液；然后，配
            为阳性对照品，生理盐水为阴性对照品。                                 制 7 mmol/L 的 ABTS 和 4.9 mmol/L 过硫酸钾溶液，
            1.2.4   提取物最低抑菌浓度（MIC）的测定                          将两者按体积比 1∶1 进行混合，避光反应 16 h，作
                 参照张勇等     [22] 的方法，具体步骤为：首先，将                 为自由基供体，使用前用体积分数为 50%乙醇稀释，
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