Page 146 - 《精细化工》2023年第6期
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·1296·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

            株式会社；Frontier 傅里叶变换红外光谱仪，美国                            首先，将 5.3 mg（9 μmol）DOX•HCl 溶解于 10
            Perkin Elmer 仪器有限公司；Evolution 220 紫外-可             mL PBS（pH=7.4）中；然后，将 20 mg FA-BCNNTs
            见分光光度计、Nanodrop 2000C 微量紫外-可见分光                    和 20 mg BCNNTs 分别加入到 2.5 mL DOX 溶液中，
            光度计、CountessⅡ细胞计数仪（配备 EVOS                TM  光    并置于 37  ℃恒温摇床中振荡 30 h，使 DOX 与
                                                                                                       4
            立方），美国 Thermo Fisher Scientific 公司；WJ-2 二          BCNNTs 充分结合；随后，将混合液以 1.5×10  r/min
            氧化碳细胞培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；                             的转速离心分离 15 min，并用 PBS（pH=7.4）洗涤
            Spark 多功能酶标仪，瑞士 Tecan 公司；DMi8 全自                   沉淀 3 次除去游离的 DOX，收集每次离心后的上清
            动倒置微分干涉显微镜，德国 Leica 公司。                            液，用于后续计算 DOX 负载量，沉淀置于 4  ℃冰
            1.2   实验方法                                         箱中保存，得到负载 DOX 的纳米复合物 BCNNTs-
            1.2.1  BCNNTs 的合成                                  DOX 和 FA-BCNNTs-DOX。DOX 在 BCNNTs 或者
                 将 2.50 g（0.23 mol）硼粉、28.23 g（0.35 mol）        FA-BCNNTs 上的负载量按式（1）计算：
            ZnO 和 1.85 g（0.0115 mol）Fe 2 O 3 分散在 50 mL 无                             m   m
                                                                                  L =  0  1             （1）
            水乙醇中，搅拌混合均匀后转移至 80  ℃真空干燥                                                  m
            箱中干燥 24 h 后，充分研磨得到混合物料约 32 g。                      式中：L 为 DOX 的负载量，mg/g；m 0 为 DOX 的初始
            称取 0.8 g 混合物料置入管式炉中，在 N 2 /H 2 混合气                 质量，mg；m 1 为游离 DOX 的质量，mg；m 为 BCNNTs
            体（H 2 体积分数为 15%）中以 10  ℃/min 的速率程                  （或 FA-BCNNTs）的质量，g。
            序升温至 650  ℃，并在该温度下保温 1 h；然后继                       1.3   表征方法与性能测试
            续以 10  ℃/min 升温到 1150  ℃，立即将 N 2 /H 2 混合               采用扫描电子显微镜对 BCNNTs 的形貌进行表
            气体通过鼓泡的方式将无水乙醇带入到管式炉中进                             征。通过 X 射线衍射仪采集 BCNNTs 的 XRD 谱图，
            行反应，整个过程中气体流量均为 50 mL/min。在                        Cu 靶（λ=0.1546 nm），扫描范围 10°~80°，扫描速率
            1150  ℃保温 0.5 h 后关闭加热使其自然降温，待管                     5 (°)/min。采用紫外-可见分光光度计测试 DOX、
            式炉冷却至室温，得到黑色蓬松丝绒状产物，质量                             BCNNTs-DOX 和 FA-BCNNTs-DOX 的 UV-Vis 吸收
            约为 200 mg。                                         光谱。采用微量紫外-可见分光光度计测试不同浓度
            1.2.2  FA-BCNNTs 的合成                               DOX 在 488 nm 的吸光度。使用 KBr 压片法采用傅
                 采用 FA 对 BCNNTs 进行修饰使其具有靶向性。                   里叶变换红外光谱仪测试 BCNNTs、FA-BCNNTs、
            首先，称取 100 mg BCNNTs 样品，加入到 100 mL                  BCNNTs-DOX、FA-BCNNTs-DOX 的 FTIR 谱图。
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            硝酸中，在室温下超声分散 6 h，在 1.5×10  r/min
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            转速下进行离心分离，将沉淀反复用去离子水清洗
                                                                   以人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞为实验对象进
            至中性，然后在台式真空冷冻干燥机–50  ℃下冷冻
                                                               行体外细胞实验。细胞采用完全培养液进行培养，
            干燥 24 h，得到含有羟基修饰的 BCNNTs（记为
                                                               然后置于含有体积分数为 5% CO 2 的 37  ℃细胞培养
            BCNNTs-OH）。接着，将 20 mg（0.045 mmol）FA                箱中进行培养。完全培养液由 DMEM 添加体积分数
            溶于 20 mL 去离子水中，并将 20 mg（0.104 mmol）
                                                               为 10% FBS、体积分数为 1%双抗（青霉素/链霉素）
            EDC•HCl 和 40 mg（0.327 mmol）DMAP 加入到 FA
                                                               以及体积分数 1% Hepes 配制而成。当细胞贴壁生长
            溶液中磁力搅拌 1 h，使 FA 活化。然后，将 20 mg
                                                               密度> 75%以后进行传代培养。
            BCNNTs-OH 加入到该混合液中继续搅拌 12 h，1.5×
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            10  r/min 下离心分离 30 min，收集沉淀，并用去离                   1.5   抗肿瘤性能测试
            子水反复洗涤沉淀以除去未反应完全的 FA。最后，                           1.5.1   细胞摄取
                                                                   采用全自动倒置微分干涉显微镜观察 MDA-MB-
            在–50  ℃下冷冻干燥 24 h，得到 FA-BCNNTs。
                                                               231 细胞对 DOX、BCNNTs-DOX 和 FA-BCNNTs-
            1.2.3  DOX 的负载
                                                               DOX 的摄取情况。具体步骤为：将 MDA-MB-231
                 FA-BCNNTs-DOX 的制备示意图如图 1 所示。                                                          5
                                                               细胞接种在 6 孔板上，每孔细胞数量为 4×10 个，
                                                               培养 24 h 后分别加入 DOX、BCNNTs-DOX、
                                                               FA-BCNNTs-DOX（DOX 等效质量浓度为 10 mg/L）
                                                               孵育 4 h；然后用 DAPI 染色 15 min，并用 PBS
                                                               （pH=7.4）洗涤 3 次；最后用全自动倒置微分干涉
                                                               显微镜对细胞进行成像。
                                                                   为了进一步研究 FA 介导的主动靶向作用，设
                    图 1  FA-BCNNTs-DOX 的制备示意图
            Fig. 1  Schematic diagram of preparation of FA-BCNNTs-DOX   计了游离的 FA 对 FA-BCNNTs-DOX 的竞争性抑制
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