Page 209 - 《精细化工》2023年第6期

第 6 期 唐裕芳，等: 酚酸结构对酚酸-g-聚甘露糖醛酸抗氧化性能的影响
溶液于 2 mL 离心管中，加入蒸馏水配成总体积为
600 µL 的溶液，然后再向每支离心管中分别加入
300 µL 的 FeSO 4 •7H 2 O 溶液和 300 µL 的 H 2 O 2 溶液，
各离心管摇晃 10 min，再向每管中加入 300 µL 水杨
酸乙醇溶液。300 µL 蒸馏水代替实验组中的 300 µL
H 2 O 2 溶液作阴性对照组。600 µL 蒸馏水代替实验组
中样品溶液作空白组。最后各离心管于 37 ℃水浴
反应 30 min，再避光冷却至室温，采用紫外-可见分
光光度计测定 510 nm 处的吸光度。根据式（2）计
算羟基自由基清除率。
超氧阴离子自由基清除率：（1）配制 0.016 mol/L
的 Tris-HCl 缓冲溶液、0.55 mmol/L 的还原性辅酶Ⅰ
（NADH）Tris-HCl 溶液、0.3 mmol/L 的硝基四氮
唑蓝（NBT）Tris-HCl 溶液、0.06 mmol/L 的吩嗪硫
酸甲酯（PMS）Tris-HCl 溶液。（2）实验组：分别量
取 25、50、100、200、400 µL 样品溶液于 2 mL 离心
管中，再分别加入不同体积的 Tris-HCl 缓冲溶液配
成总体积为 700 µL 的溶液，然后依次向每管中加入
NADH 溶液、NBT 溶液、PMS 溶液各 100 µL。100 µL
Tris-HCl 缓冲溶液替代实验组中的 100 µL NBT 溶液
作阴性对照，700 µL Tris-HCl 缓冲溶液加入 NADH
溶液、NBT 溶液、PMS 溶液各 100 µL 作空白组。
各离心管中溶液摇匀后，避光静置 5 min，然后采用
紫外-可见分光光度计测定 560 nm 波长处的吸光
度。根据式（2）计算超氧阴离子自由基清除率。
自由基清除率/%=100×[A 0 –(A–B)]/A 0 （2）
式中：A 0 为空白组的吸光度；A 为实验组的吸光度；
B 为阴性对照组的吸光度。
铁还原力测定：（1）配制 pH 6.8 的 PBS 缓冲溶
液、0.03 mmol/L 铁氰化钾溶液、0.006 mmol/L 三氯
化铁（FeCl 3 ）溶液、0.6 mmol/L 三氯乙酸（TCA）
溶液。（2）实验组：量取 25、50、100、200、300 µL
样品溶液于 2 mL 离心管中，加入蒸馏水配成总体积
为 300 µL 的溶液，再加入 300 µL PBS 缓冲溶液、
300 µL 铁氰化钾溶液。以 300 µL 蒸馏水代替实验组
的样品溶液为空白对照。离心管中溶液混匀后于
50 ℃水浴加热 20 min 后，迅速冰水浴冷却至室温，
再向离心管中加入 300 µL 的 TCA 溶液，混匀，
3500 r/min 离心 10 min，移取上清液 500 µL 于 2 mL
离心管中，加入 500 µL 蒸馏水和 100 µL FeCl 3 溶液，
摇匀后静置 10 min，采用紫外-可见分光光度计测定
离心管中溶液在 700 nm 波长处的吸光度。整个操
作过程均需在避光条件下进行。根据式（3）计算
铁还原力。
铁还原力=A 1 –A 0 （3）
式中：A 0 为空白组的吸光度；A 1 为实验组的吸光度。
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2 结果与讨论
2.1 PM-EDA 的合成
在活化剂 EDC/NHS 作用下，EDA 取代了 PM 分
子中羧基官能团上的羟基 [10,18] ，生成端基有氨基的酰
胺化合物 PM-EDA。PM-EDA 的合成示意图见图 1a。
在 PM-EDA 合成反应中，反应物比例、活化剂
比例、pH、反应时间会影响 PM-EDA 的取代度。因
此，本文对这 4 个影响 PM-EDA 合成的因素进行了
优化，结果见图 2。
图 2A 显示了固定 PM (0.30 g)、EDC (1.44 g)和
NHS (0.36 g)的添加量，在 pH 7.5 反应 24 h，反应
物比例〔(n(PM)∶n(EDA)〕对产物 PM-EDA 取代度
的影响。由图 2A 可知，当 n(PM)∶n(EDA)由 1∶1
减小到 1∶1.5 时，PM-EDA 的取代度呈现显著上升
趋势，在 n(PM)∶n(EDA)=1∶1.5 时取代度最高，为
9.25%；当 n(PM)∶n(EDA)由 1∶1.5 减小到 1∶2 时，
PM-EDA 取代度呈显 著下降趋 势，继续 减小
n(PM)∶n(EDA)，PM-EDA 的取代度无显著变化。
这可能是因为 EDA 比例增大使反应体系的 pH 增
大，不适 合 PM-EDA 生成。 TAN 等 [19] 在利用
EDC/NHS 催化 α-硫辛酸的羧基与壳聚糖的氨基反
应也获得与本工作类似的结果。因此，本研究选择
合成 PM-EDA 的最佳 n(PM)∶n(EDA)为 1∶1.5。
图 2B 显示了固定 PM (0.30 g)，EDC (1.44 g)和
NHS (0.36 g)添加量，在 n(PM)∶n(EDA)为 1∶1.5、
pH 7.5 时，反应时间对 PM-EDA 取代度的影响。由
图 2B 可知，当反应时间在 8~24 h 时，PM-EDA 取
代度由 2.66%增加到 9.84%，继续延长反应时间至 36
h 时，PM-EDA 的取代度不再增加反而稍有下降，由
反应 24 h 时的 9.84%逐渐下降到 9.31%，但不显著
（p>0.05）。这可能是因为反应 24 h 后，PM 中的羧
基基本已与 EDA 反应，并达到一个动态平衡。因此，
本研究选择合成 PM-EDA 的最佳反应时间为 24 h。
图 2C 显示了固定 PM (0.30 g)，在 n(PM)∶
n(EDA)=1∶1.5，pH 7.5 下反应 24 h，不同活化剂比
例〔n(PM)∶n(EDC)∶n(NHS)〕对 PM-EDA 取代度
的影响。由图 2C 可知，当 n(PM)∶n(EDC)∶n(NHS)
由 1∶1∶1 变到 1∶2∶1 时，PM-EDA 的取代度由
7.99%增加到 12.63%，达到最大。然后随着活化剂
比例的变化，PM-EDA 取代度呈下降趋势。在此催
化反应体系中，首先 PM 的羧基与 EDC 反应生成
O-酰基异脲，但 O-酰基异脲在水溶液中很容易被水
解，而 NHS 能使 O-酰基异脲转化成有胺活性的 NHS
酯，最后与 EDA 上氨基反应生成 PM-EDA。活化剂
比例可能影响由 EDC 介导的偶联反应。因此，本研
究选择合 成 PM-EDA 的活化剂比例 n(PM) ∶
n(EDC)∶n(NHS)=1∶2∶1。