Page 141 - 精细化工2019年第12期
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第 12 期               徐雅琴，等:  乙酰化修饰对黑穗醋栗果实多糖结构特性及活性的影响                                   ·2469·


            1.2.2   黑穗醋栗果实乙酰化多糖的制备                             量浓度为 2.0  g/L 的多糖样品溶液，加入 2.0  mL 刚
                 参考 Ma 等人    [16] 的方法制备乙酰化多糖，稍作                果红试剂（80 μmol/L），摇匀。再加入一定量的 NaOH
            修改。取 200.0  mg 黑穗醋栗果实多糖（BP）加                       溶液（1.0 mol/L），使 NaOH 终浓度达到 0~0.5 mol/L。
            20.0 mL 吡啶，60  ℃下搅拌 30 min。然后分别加入                  利用紫外-可见光谱扫描，测量不同 NaOH 浓度下样
            乙酸酐（2.5、5.0、7.5、10.0、12.5  mL）和吡啶的                 品溶液的最大吸收波长。
            混合溶液 20.0 mL，在 40  ℃下磁力搅拌反应 4 h。                       将样品平铺于金属片的导电胶片上，放入真空
            反应停止后，将 250 mL 去离子水加入到反应液，反                        喷镀仪内，利用 S-3400N 型扫描电子显微镜对其外
            应液旋蒸浓缩后，用体积分数 80%的乙醇醇沉，得                           貌进行分析。
            到沉淀。用去离子水将沉淀溶解、旋蒸浓缩、去离                             1.2.6   自由基清除能力测定
            子水透析（3500  Da，72  h）、旋蒸浓缩、冷冻干燥                         参考文献方法      [13] ，在 0.2~1.0 g/L 质量浓度范围
            （–80  ℃），即得到 5 种不同取代度的黑穗醋栗果实                       内，测定 BP、ABP-1、ABP-2 和 ABP-3 对 DPPH•，
            乙酰化多糖，选择低、中、高 3 种取代度的乙酰化                           OH•和 O 2 •清除能力，V C 为阳性对照。
                                                                      –
            多糖，对应乙酸酐用量分别是 2.5、5.0、10.0 mL，
                                                               1.2.7   α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
            分别命名为 ABP-1、ABP-2 和 ABP-3，进一步进行                                     [14]
                                                                   参考文献方法          ，测定不同质量浓度（0.2~
            结构特性测定和活性探究。                                       2.0 g/L）的多糖样品对 α-淀粉酶（底物为淀粉）和
                                              [5]
                 多糖取代度的测定参考 Xie 等人 的方法。称
                                                               α-葡萄糖苷酶（底物为 pNPG）的抑制活性，阿卡波
            取 20.0  mg 乙酰化多糖溶解于 10.0  mL  NaOH 溶液
                                                               糖作为阳性对照。根据式（3）计算抑制率（IR）。
            （0.01 mol/L），水浴振荡器下反应 2 h（50  ℃），冷
                                                                                      a
            却至室温。以酚酞为指示剂，过量碱用 0.01  mol/L                                 ΙR / %       1  A   A   b      100  （3）
                                                                                      c 
            HCl 反滴定至红色消失，未加乙酰化多糖的溶液作                                                 A   A d  
                                                               式中：A a —样品实验组的吸光度（样品+酶+底物的
            为空白。乙酰基的质量分数（A）和取代度（DS）
            分别按式（1）、（2）计算。                                     吸光度）；A b —样品对照组的吸光度（样品+底物的
                           (     )V   1 V   0 C    3   4  3  吸光度）；A c —空白实验组的吸光度（酶+底物的吸
                     A / %   1  2              100    （1）    光度）；A d —空白对照组的吸光度（底物的吸光度）。
                                   m
                                  162 A                       1.2.8   α-葡萄糖苷酶活性抑制动力学研究
                            DS                      （2）                         [17]
                                     
                                 4300 42A                          按照文献的方法          ，稍加修改。将 40 μL 质量
            式中：A 为乙酰基质量分数，%；V 1 、V 2 分别为滴                      浓度分别为 0、0.4、0.8、2.0 g/L 的样品溶液与 20 μL
            定空白和样品溶液消耗 HCl 的体积，mL；C 为 HCl                      pNPG（2.0  mmol/L）依次加入到 96 孔板中，混匀
            溶液的浓度，mol/L；m 为样品质量，g。                             后于 37  ℃的全温振荡培养箱中保温 5 min，依次加
            1.2.3   单糖组成分析                                     入 40 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.08、0.16、0.32、0.64、
                 根据文献[15]对多糖进行单糖组成分析。多糖                        1.28 和 2.56 U/mL）以启动反应，振摇 1 min，用酶
            样品 30 mg 溶解在 2 mL 三氟乙酸（2 mol/L）溶液                  标仪在 37  ℃下每隔 1  min 测定吸光度（A 405 ），测
            中，在 100  ℃下水解 6 h。将酸水解后的 BP、ABP-1、                 定 25 min，根据吸光度随时间呈线性变化部分的变
            ABP-2、ABP-3 和单糖标准品进行衍生化，然后利                        化值除以时间计算反应速率 v。以酶浓度和反应速
            用气相色谱进行检测（标准品采用混合进样，肌醇                             率为横纵坐标绘制曲线，判断多糖对 α-葡萄糖苷酶
            为内标）。                                              活性抑制类型。然后固定酶浓度（0.32  U/mL），改
                 气相色谱条件：RTX-1701 石英毛细管色谱柱                      变 pNPG 的浓度（1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 mmol/L），
            （0.25 μm×30.0 m）；检测器：氢火焰离子化检测器                     按照上述方法处理，测定吸光度。用 Lineweaver-
            （FID）；载气：高纯 N 2 ；程序升温：190~220  ℃                   Burk 双倒数作图法确定黑穗醋栗果实乙酰化多糖酶
            （5 ℃/min，5  min），220~260  ℃（10  ℃/min，             动力学反应类型，计算反应速率常数 K i               [18] 。多糖溶
            20 min）；检测器温度 250  ℃；汽化温度 280  ℃。                  液、pNPG 及 α-葡萄糖苷酶溶液皆用磷酸盐缓冲液
            1.2.4   红外光谱分析                                     （0.1 mol/L，pH 6.86）配制。
                               –1
                 在 4000~500 cm 内，利用 FTS135 型傅里叶变               1.3    数据分析
            换红外光谱仪对 BP、ABP-1、ABP-2 和 ABP-3 进行                      所有实验均平行做 3 次，结果表示为：平均值±
            红外光谱测试。                                            标准偏差（mean ± SD）。采用  origin 8.0  软件绘图，
            1.2.5   刚果红实验和扫描电镜测定                               并用 SPSS 20.0 软件进行差异显著性分析，以 P<0.05
                 根据文献[15]进行刚果红实验。移取 2.0 mL 质                   作为显著性差异标准。
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