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第 4 期                     张孝焱，等:  谷胱甘肽-富勒烯光敏剂的合成及光动力学                                    ·585·


                 由于分子间氢键作用，水溶性富勒烯衍生物在                          伤，因此在避光条件下，使用 5~50 mol/L 的 C 60 -
            水溶液中倾向于自组装形成稳定的纳米颗粒                     [14-15] ，  OH-GSH 与 HEK-A 和 HM 细胞孵育 24  h 后，检测
            纳米粒子的尺寸、稳定性和表面电荷对其生理活性                             细胞活性的变化以评估其生物安全性，如图 4a 所
            具有重要影响       [16] 。C 60 -OH-GSH 的水合粒径集中分           示。在 5~20 mol/L 内，C 60 -OH-GSH 对 HEK-A 和
            布在 126 nm 左右（图 1c），PDI 为 0.198，说明其在                HM 无抑制生长作用，在 50 µmol/L 的高浓度下也仅
            水溶液中聚集尺寸较小，容易被细胞摄取。Zeta 电                          表现出轻微的抑制作用，主要可能是由于高浓度的
            势可以反映纳米颗粒表面的电荷情况及其在溶液中                             药物稀释在培养基中，改变了细胞培养基的渗透压，
            的稳定性，C 60 -OH-GSH 的 Zeta 电势分布在39 mV               但细胞存活率仍在 95%以上。因此，可以证明在避
            附近，这是由于其表面修饰的羟基和羧基在水溶液                             光条件下，浓度为 50  mol/L 的 C 60 -OH-GSH 对于
            中解离而使整个纳米颗粒带负电荷，同时，也说明                             正常细胞没有损伤，具有显著的生物安全性。
            其纳米颗粒之间存在较强的电荷排斥作用，从而能
            够稳定地存在于水溶液体系中。
                 为了确定键合在富勒烯碳笼表面的 GSH 数量,
            对冷冻干燥的粉末状样品进行 C、N 元素含量分析。
            N 元素来源于 GSH，C 元素来源于 C 60 和 GSH。C 60 -
            OH-GSH 中 C、N 的质量分数分别为 53.38%和
            3.60%，根据 N 和 C 质量比可以计算得到平均每个
            富勒烯碳笼 C 60 上键合有 1.7 个 GSH 分子，证明将
            少量的 GSH 分子和羟基修饰在碳笼表面即可提高
            C 60 的水溶性，有利于保留碳笼的大共轭结构，此外
            通过计算平均相对分子量可实现对溶液定量以评估
                                                                                        2
                                                               图 3  C 60 -OH-GSH 在 20 mW/cm 的光强下照射 2 min 产生
            其作用效率。                                                  ROS 的效率
                 C 60 -OH-GSH 可均匀分散在生理盐水、PBS、FBS               Fig.  3    Efficiency  of  ROS  production  by  C 60 -OH-GSH
                                                                                   2
            和 DMEM 中，高速离心后无沉淀产生（图 2），说                                under 20 mW/cm  irradiation for 2 min

            明纳米颗粒在以上 4 种生理溶液中均表现出较高的
                                                                   在光照条件下，C 60 -OH-GSH 会产生过量的 ROS
            稳定性，这与 C 60 -OH-GSH 纳米颗粒均匀分散的水
                                                               诱导细胞损伤，从而导致细胞的活性下降。如图 4b
            合粒径及其表面的负电荷（39 mV）是相对应的，
                                                               所示，将浓度为 1~20  mol/L 的 C 60 -OH-GSH 处理过
            其在生理溶液中优异的稳定性有利于其与细胞产生
                                                               的 U87-MG、A549、HepG2 和 DU145 细胞在 20 mW/cm     2
            有效的相互作用。
                                                               的光强下照射 10 min，细胞活性显著降低。只光照
                                                               的 Light 组的细胞活性相比于对照组没有变化，说
                                                               明光照没有损伤细胞。相比而言，1  mol/L 的 C 60 -
                                                               OH-GSH 就会产生光动力效果杀伤肿瘤细胞，4 种
                                                               肿瘤的活性下降至 60%~90%，并且对于细胞的损伤
                                                               效果随着 C 60 -OH-GSH 浓度的增加而显著提高。

                                                               C 60 -OH-GSH 对于 4 种肿瘤细胞的光动力损伤也是
            图 2    离心前后，C 60 -OH-GSH 在不同生理溶液中的照片。
            Fig. 2    Optical images  of C 60 -OH-GSH  in  physiological   与其诱导产生 ROS 的含量相一致的，从而在细胞水
                   media before and after centrifugation       平证明了 C 60 -OH-GSH 的光动力效果。

                 ROS 可以通过其氧化 DCFH 产生 DCF 的荧光强                  2.2.2    激光共聚焦成像分析
            度来定量检测，ROS 含量与荧光强度呈线性正相关。                              细胞内生成的 ROS 可以通过 H2DCFDA 检测，
                                   2
            由图 3 可见，在 20 mW/cm 的光强下照射 10 min 后，                H2DCFDA 在细胞内水解为 DCFH，DCFH 进一步
            C 60 -OH-GSH在1 µmol/L的极低浓度下就能显著地产                  被 ROS 氧化为绿色荧光的 DCF，其荧光强度可以
            生 ROS，并且 ROS 的产生量随着 C 60 -OH-GSH 浓度                定量反映细胞内的活性氧水平。如图 5a 所示，将与
            的提高而增加，从而证明 C 60 -OH-GSH 在光照下能够                    10 µmol/L C 60 -OH-GSH 孵育过的 U87-MG、A549、
                                                                                               2
            快速诱导产生活性氧，是一种非常高效的光敏剂。                             HepG2 和 DU145 细胞在 20  mW/cm 的光强下照射
            2.2    细胞毒性测试                                      10  min，可以观察到细胞核（蓝色荧光）周围出现
            2.2.1    暗毒性测试及 PDT 效果检测                           大量的绿色荧光（图 5a），从而证明 C 60 -OH-GSH 进
                 理想的光敏剂在避光条件下应该对细胞没有损                          入细胞后在光激发作用下产生了大量的 ROS。
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