Page 101 - 201907

第 7 期 余带兵，等: NMN 转移酶和乙醇脱氢酶共固定化及其动力学特性 ·1347·

2+
中的循环利用，以提高其生物合成 NADH 的能力。 NMN、50 mmol/L ATP、50 mmol/L Mn 、质量分数
[3]
例如：Suye 等 曾利用苹果酸酶假单胞菌 hyputa 为 2%的乙醇中，加入 1.2.1 制备的共固定化双酶，
+
IFO-13182 催化 NAD 合成 NADH，通过优化 NAD + 混匀。所有液体都用 ddH 2 O（双蒸水）配制。然后
[4]
转化率达到 100%。Šilhánková 等 在 13 种细菌菌株 置于 7 ℃的恒温水浴锅中振荡反应 2 h，沸水浴
和 4 种酵母样生物中，筛选出两种细菌和一种酵母 1 min 终止酶反应，反应液冰浴冷却 8000 r/min 离心
菌株的透化细胞，能在葡萄糖作为底物的条件下有 1 min，取上清液，并在 340 nm 处测定反应产物的
+
效地将添加的 NAD 转化为 NADH，转化效率最高 吸光值 OD 340 ，代表 NADH 产量。以不加底物 NMN
[5]
可达 90%。Itoh 等 则通过 NADH 的再生提高了棒 的空白做对照。
状杆菌苯乙醛还原酶（PAR）合成手性醇的能力。 NADH 浓度按下式计算：
[6]
Samuel 等 设计两种不同 NADH 再生系统的全细胞 c=ΔA/(Kb) （1）
生物催化剂工艺提高了枯草芽孢杆菌 168 生产 式中：ΔA 为吸光度变化值；K 为摩尔吸光系数，它
2,3-BD 的能力。以上研究均采用细胞作为研究对象
与吸收物质的性质及入射光的波长 λ 有关；b 为吸
提高 NADH 的生产能力和再循环，从而降低生产成 [12-13]
收层厚度，单位为 cm 。
本，但采用酶法生产 NADH 却鲜有研究，尤其是利
酶活定义为：在 37 ℃，1 mL 反应体系中，1 min
用多酶催化体系从烟酰胺单核苷酸 NMN 出发通过
催化得到 1 mmol NMN 的酶量为 1 U，比酶活用
双酶催化合成 NADH。在多酶催化体系中，共固定
U/mg 或 U/g 表示。
化酶体系不仅能提高酶的热稳定性和连续操作能
剩余酶活/%=共固定化双酶重复使用第 n 次后残留酶活/
力，而且有利于充分发挥多酶体系的协同催化作用，
共固定化双酶第 1 次使用时残留酶活×100 （2）
实现高效转化。因此，本文拟以醛基化的四氧化三
NADH 产率/%=共固定化双酶实际催化所得 NADH 产量/
铁磁性纳米颗粒为固定化载体，对 NMN 转移酶和
共固定化双酶理论 NADH 产量×100 （3）
乙醇脱氢酶进行共固定，研究共固定化条件和固定
1.2.3 共固定化双酶条件的研究
化性能，并对其固定化双酶的催化动力学进行预测，
称取定量的 Fe 3 O 4 @SiO 2 -HN=CH(CH 2 ) 3 CHO 纳
以期提高生物催化合成 NADH 的效率。
米颗粒，采用 1.2.1 节方法在不同条件下共固定化
1 实验部分 NMN 转移酶和乙醇脱氢酶，考察 NMN 转移酶
（3.2~9.7 U/mg）和乙醇脱氢酶（2.1~12.4 U/mg）
1.1 主要试剂 的添加量、固定化 pH（4.0~10.0）、固定化时间
[7]
NMN 转移酶粗酶液，自制 ；乙醇脱氢酶、三 （0.5~3.0 h）、固定化温度（15~40 ℃）对 NADH
磷酸腺苷（adenosine triphosphate，简称 ATP）， 产率的影响。
100 mmol/L，生工生物工程上海股份有限公司；四 1.2.4 共固定化双酶操作稳定性研究
氧化三铁纳米颗粒，20 nm，苏州恒球石墨烯科技有 将一定量的共固定化双酶按照 1.2.2 节方法测
限公司；三丙氨基三乙氧基硅烷（APTES，分析纯）、 定 NADH 产量，反应结束后磁力倾析，PBS 缓冲液
戊二醛（质量分数为 25%水溶液），上海国药集团化 冲洗数次，继续测定 NADH 产量，将第一次检测的
学试剂有限公司。 产量定义为 100%，洗净后用于下一批次的催化反应，
1.2 方法 连续使用多次，检测固定化酶的操作稳定性。
1.2.1 纳米微粒固定化双酶的制备
1.2.5 固定化双酶的反应动力学方程
将实验室自制的 Fe 3O 4@SiO 2-HN=CH(CH 2) 3CHO 按照 1.2.1 方法共固定化双酶后，在 ATP、乙醇
纳米颗粒 [8-11] 0.5 g 分散在 10 mL pH=8.0 的磷酸盐
等底物充足的条件下，通过不断改变 NMN 的浓度，
缓冲溶液中，然后将 8.2 U/mg NMN 转移酶和
按照 1.2.2 测定其 NADH 产量的变化，以研究其动
10.3 U/mg 乙醇脱氢酶加入到锥形瓶中的缓冲溶液
力学原理。
中，在 25 ℃下振荡 1.5 h。然后磁性分离并洗涤数
次，直到在漂洗溶液中没有检测到游离双酶，保存 2 结果与讨论
在 4 ℃冰箱中。
1.2.2 固定化效率的测定 2.1 双酶固定化次序对固定化效果的影响
本研究中固定化效率以测定产物 NADH 产量 在双酶固定体系中，酶固定先后次序会因载体
表征。 表面与酶结合位点的有限性以及当一种游离酶与固
在 1 mol/L pH=7.5 Tris-HCl 缓冲液、300 mmol/L 定化载体结合后产生的空间位阻从而影响另一种酶