Page 104 - 201907

·1350· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 36 卷

乙醇的浓度远远大于底物 NMN，通过改变 NMN 的 程中纵轴斜率为 1/V max ，斜率为 K m /V max [25] ，即可得
添加量，研究固定化双酶生产 NADH 的动力学。 到 V max 和 K m。由图计算可得，固定化 NMN 转移酶的
（1）固定化双酶遵循如下反应模型 K m1=3.49~3.55 mmol/L，V m1=2.78~2.83 mmol/min；同
1 k
2 k
E +S  E S  E +P （4） 理，可得出固定化乙醇脱氢酶的动力学参数为

1 k  1 1 1 1 K m2 =(1.84±0.23) mmol/L，V m2 =8.5~6.1 mmol/min。
3 k
E  2 P  E P  2  1   4 k  E  2 P 2 （5）
1
3 k 
（2）假设第一步反应中产生的 P1 全部被第二
步反应完全利用，且两步反应均在保持稳态的前提
下进行。
[ k ]E P  [ ] k E S  [ ]k P E （6）
[
]
3  2 1 2 1 3 1 2
V []S
V  m 1 （7）
1
[] S  K m 1
V []P
V  2 m 1  （8）
2
P
1
[] K m 2
Vk ] （9）
=[E S
1 2 1 图 6 固定化 NMN 转移酶的双倒数曲线
]
V =[k E P （10） Fig. 6 Double reciprocal curve of immobilized NMN
2 4 2 1
由公式（7）、（8）、（9）、（10）推导可得： transferase

K
[]  m 2 V （11） 图 7 为固定化双酶的 Lineweaver-burk 双倒数曲
P
1
2
V m 2  V 2 线图，由图中参数可计算出 a=0.3819±0.032 时，固
将上式以及公式（7）、（8）、（9）、（10）带入（6）
定化双酶的 1/V 和 1/[S]呈线性关系，且其速率为 V 1
可得： 的 1/a，其动力学模型符合模拟计算公式（8）的结
aV []S
V 2 = m 1 （12） 果，即固定化双酶反应速率主要取决于固定化乙醇
[]S  K m 1 脱氢酶的反应速率即 V 2 。在实验数据中可以分析出，
将其化为双倒数公式，为：
在第一步反应和第二步反应中，遵循稳态的动力学
1 K 1 1
= m 1  假设，并且第一步反应的产物完全被下一步反应所
V aV [] S aV
2 m 1 m 1 利用。综上所述，在固定化双酶的反应过程中，随
(
kV  V )
a  4 m 2 2  （13） 着底物的不断消耗，产物 NADH 的生成速度遵循
kk V m 2 [ K 2 ]E  k V 2  k V


3 m
3 2
43 2
假设固定化双酶的反应速率主要取决于固定化 2.3.1 模拟推导出的动力学方程，此时共固定化双酶
的 动力学参 数为 V m3 =aV m1 =0.97 mmol/min~
NMN 转移酶的反应速率即 V 1 ，则：
V []S 1.17 mmol/min，K m3 =K m1 =3.49~3.55 mmol/L。
V  V  1 m 1 （14）
[] S  K m 1
假设固定化双酶的反应速率主要取决于固定化
乙醇脱氢酶的反应速率即 V 2 ，则：
aV []S
V  V  2 m 1  （15）
[] S  K m 1
由此可见，在上述假设条件成立前提下，双酶
共固定化进行催化反应合成 NADH 动力学方程依然
可以用米氏方程进行表征，其催化动力参数均可
确定。
2.3.2 动力学方程参数的确定
图 7 固定化双酶催化反应动力学
在 ATP 和乙醇量远高于 NMN 前提下，通过配
Fig. 7 Immobilized double enzyme catalytic reaction kinetics
制不同浓度的 NMN，采用 Lineweaver-burk 双倒数
法，对共固定化双酶动力学参数进行确定，其实验 符号说明：V 1 —NMN 转移酶的反应速度，
结果与单酶固定化（NMN 转移酶）催化动力学参数 mmol/min；V 2 —乙醇脱氢酶的反应速度，mmol/min；
进行对比。以 1/V 对 1/[S]作图，得图 6，由米氏方 K m1 —NMN 转移酶的米氏常数；K m2 —乙醇脱氢酶的