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第 7 期 余带兵，等: NMN 转移酶和乙醇脱氢酶共固定化及其动力学特性 ·1349·
的酶量刚好达到饱和状态；之后，随着固定化时间 ADH 的酶量为 10.3 U/mg，不断增加 NMN 转移酶
的延长，共固定化效率下降，此时载体负载达到饱 的添加量，当 NMN 转移酶量较低时，NADH 产率
和状态，并且有大量游离酶的浪费。酶活降低可能 随之不断增加，在 6.5 U/mg 时达到最大，此后随着
是长时间的固定化导致部分酶失活，并且载体的载 NMN 转移酶的增加，NADH 产率逐渐减小。在图
酶量有限，固定时间过长导致酶的空间增大，固定 4b 中，同样在载体量一定的前提下，固定 NMN 的
化酶的酶活位点被掩盖，酶活降低 [22] 。从共固定化 酶量为 6.5 U/mg，改变 ADH 的添加量，当其在
效率的角度出发，选择 2.0 h 的固定化时间为宜。 2.1~8.2 U/mg 之间时，NADH 产率随着 ADH 添加量
的增加而增加，当 ADH 达到 10.3 U/mg 时 NADH
产率为 87%，之后随着 ADH 增加，NADH 产率与
图 4a 一致出现下降的趋势，而游离酶催化的效率为
73%，共固定化最大产率与游离酶催化结果相比较
提高了 14%。Poojari 在研究纳米材料固定化脂肪酶
时提出定量载体对酶分子包埋量是确定的 [23] ，加酶
量过大，酶分子活性部位被掩盖或者酶大量聚集在
载体表面，反而导致酶与底物无法充分接触，表现
出较低的产率 [24] 。因此，在本实验范围内 NMN 转
移酶和 ADH 添加量分别为 6.5 和 10.3 U/ mg。
图 3 共固定化时间对 NADH 产率的影响 2.2.5 共固定化双酶操作稳定性
Fig. 3 Effect of immobilization time on NADH yield 采用修饰后的磁性纳米颗粒为固定化载体，以
共价固定法共固定 NMN 转移酶和 ADH，在 Tris-HCl
2.2.4 载体载酶量的确定
缓冲液中反应，每一批次反应后磁力倾析出固定化
在载体量一定（0.5 mg）前提下，载体载酶量
酶继续进行下一批次反应，结果见图 5。共固定化
是影响 NADH 产率的主要因素之一，对双酶添加量
双酶连续反应 11 批后，剩余酶活为初始值的 61.1%，
进行考察，具体方法参见 1.2.1，结果见图 4。 显示出共固定化双酶具有良好的操作稳定性，实现
了双酶的重复利用，有效地节约酶在工业应用中的
成本。
图 5 共固定化双酶的操作稳定性
Fig. 5 Operational stability of co-immobilized double enzyme
2.3 固定化双酶的反应动力学方程确定
2.3.1 动力学方程的推导
米氏方程是指每个酶分子只有一个结合位点，
反应中只形成一种配合物的单底物酶促反应。这种
反应很少见，但在多底物反应中，如果只有一种底
物浓度发生变化，其他底物浓度都保持不变，那么
图 4 双酶添加量对 NADH 产率的影响
Fig. 4 Effects of double enzyme addition on NADH yield 可纳入准单底物反应。因此，本研究在此理论的基础
上，研究双酶催化多底物动力学是否符合米氏方程。
如图 4a 所示，在载体量一定的前提下，固定 在多底物反应双酶催化过程中假设底物 ATP 和
