Page 123 - 精细化工2019年第8期
P. 123

第 8 期                      王   幻，等:  橙皮苷酶解液中橙皮素单糖苷的分离纯化                                 ·1611·


                 橙皮素单葡萄糖苷（hesperetin-7-O-glucoside，            的 HMG 单体进行纯度测定和结构验证；同时，对
            HMG，Ⅰ）又称橙皮素-7-O-葡萄糖苷，是橙皮苷（Ⅱ）                       橙皮素及其糖苷组分进行了体外抗氧化性能的比
            去掉一分子鼠李糖后所得的产物，故而与橙皮苷有                             较。此研究可为工业化大规模生产高纯度甜味剂前
                                     [1]
            相似的生理活性和化学结构 。近年来，HMG 的合                           体物质 HMG 提供理论和实践参考。
            成方法主要采用生物转化法              [2-3] ，即以橙皮苷为原
            料，采用一种橙皮苷复合酶（Hesperidinase）              [4-5] 制   1   实验部分
            备 HMG 粗酶液。HMG 加氢后可用于生产超级甜味
                                                               1.1    试剂与仪器
            剂葡萄糖基橙皮素二氢查耳酮，其甜度约为蔗糖的                                               [18]
                                                                   橙皮苷酶，自制          ；橙皮苷粗品，工业级，山
            200~2000 倍，同时它也是酶法合成新型甜味剂新橙                        东奔月生物技术有限公司；橙皮苷、HMG 及橙皮素
                                 [6]
            皮苷二氢查尔酮的底物 ，对国内制糖产业具有较                             标准品，美国 Sigma 公司；乙腈，色谱纯，广州丛
                                                   [7]
            大的推动作用。此外，HMG 还有预防癌症 、抗病                           源实验仪器有限公司；无水乙醇、柠檬酸、柠檬酸
                      [9]
              [8]
            毒 、抗菌 、抗氧化          [10] 、镇定 [11] 、保鲜 [12] 和抑制
                                                               钠、葡萄糖、N,N-二甲基甲酰胺（DMF），分析纯，
            黑色素等方面的作用，所以，将 HMG 粗酶液进行
                                                               国药集团化学试剂有限公司；DM130、HPD300、
            分离纯化得到高纯度的单体 HMG，是获取功能性高
                                                               AB-8、HPD100、HPD200A、DA201-B 型大孔吸附
            倍甜味剂的一个关键。
                                                               树脂，郑州勤实科技有限公司。
                                                                   LC-100 型高效液相色谱仪，上海伍丰仪器有限
                                                               公司；SHA-BA 型水浴恒温振荡器，金坛市宏华仪
                                                               器厂；KA-1000 型离心机，上海安亭科学仪器厂；
                                                               CP224C 型电子天平，奥豪斯仪器有限公司；BT100S
                                                               型恒流泵，雷弗仪器有限公司；RE-52AA 型旋转蒸
                                                               发仪，上海亚荣生化仪器厂；SCIENTZ-18N 型真空
                                                               冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；
                                                               LC-20AT 型半制备液相色谱仪，日本岛津仪器公司。
                                                               1.2   方法
                                                               1.2.1    HMG 酶解液的制备

                                                                   按照文献[19]的方法，用 50 mmol/L pH=4.0 柠
                 据报道，目前黄酮类化合物的分离纯化方法有                          檬酸缓冲液（含适量 DMF）配制 0.3  g/L 橙皮苷底
            很多种，如树脂法、重结晶法、色谱分离法、膜分                             物溶液，随后加入 15.69 U 橙皮苷酶液和 3.61 g/L 葡
            离法和柱层析法等         [13-14] 。其中，大孔吸附树脂具有              萄糖。在 60 ℃的水浴摇床(200 r/min)上反应 5 h，取
            较高的稳定性、较大的比表面积、富集效果明显、可再                           出沸水浴灭活 30 min。在 4000 r/min 的离心机上离
            生重复利用和不受酸碱及有机溶剂的影响等特点                    [15-16] ，  心 20 min，上清液即为含 HMG 的酶解液。
            已被广泛用于黄酮类化合物的分离纯化应用中。由                             1.2.2    高效液相色谱条件
            于 HMG 粗酶液中 3 种主要组分橙皮苷、HMG 和橙                           色谱柱：Wondasil C 18 分析柱（250 mm×4.6 mm×
            皮素的化学结构极其相似，很难用一般的方法对目                             5 μm）；流动相：乙腈-甲酸溶液（A：体积分数 0.1%
                                        [1]
            标组分 HMG 进行分离，单艳等 采用硅胶柱法分离                          的甲酸水溶液；B：乙腈）；梯度洗脱程序（百分数
            得到 HMG 的质量分数为 91.71%，而马丽萍等                [17] 通   表示体积分数，0~1 min，85.0% A；1~5 min，85.0%
            过化学萃取和硅胶柱色谱分离相结合的方法得到                              A  →75.0% A；5~15 min，75.0% A→60.0% A；15~25
            HMG，其质量分数也只达到了 95%左右。目前仍鲜                          min，60.0% A  →50.0% A；25～30 min，50.0% A  →
            见有较高纯度的单体 HMG 的分离纯化相关报道。                           85.0% A）；紫外检测波长：283 nm；流速 1 mL/min；
                 本文旨在集成树脂法和半制备液相色谱法，分                          反相柱的柱温：35 ℃；进样量：20 μL。
            离橙皮苷酶解液中橙皮素单葡萄糖苷等关键的甜味                             1.2.3    大孔吸附树脂的预处理
            剂前体物质：比较 6 种大孔吸附树脂并选择一种大                               将适量 DM130、HPD300、AB-8、HPD100、
            孔树脂对橙皮苷酶解液中 HMG 等组分进行富集和                           HPD200A、DA201-B 型大孔吸附树脂，按照文献方
            分离纯化，去除糖类杂质；采用半制备液相色谱法                             法 [20] 进行预处理，以除去树脂中残留的杂质，备用。
            对 HMG 进行进一步分离纯化，分离橙皮素、橙皮                           1.2.4    大孔吸附树脂的筛选
            苷和 HMG，得到主要组分 HMG 单体，并对纯化后                             吸附量的计算：准确称取 0.5 g 预处理后的大孔
   118   119   120   121   122   123   124   125   126   127   128