Page 124 - 精细化工2019年第8期
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·1612·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

            吸附树脂于锥形瓶中，加入 200 mL HMG 酶解液，在                      柱温 25 ℃；进样量 2 mL；流速 10 mL/min；流动相：
            30 ℃恒温水浴摇床上以 200  r/min 的转速振荡，并定                   乙腈和水（A：超纯水；B：乙腈）。梯度洗脱程序
            时吸取酶解液用高效液相色谱仪测定 HMG 等主要                           （百分数表示体积分数，0~10 min，90.0% A；10~12 min，
            组分的含量，由式（1）计算各树脂对酶解液中主要                            90.0% A  →85.0% A；12~60 min，85.0% A  →75.0%
            组分的吸附量。                                            A；60~75 min，75.0% A  →50.0% A；75~80 min，50.0%
                                       (      )    V       A  →0 A，80~90 min，0 A  →90.0% A）。
                       吸附量   /(mg /g)   0   t        （1）
                                           m 0                     将经大孔树脂纯化富集后的样品进一步用半制
            式中：ρ 0 、ρ t 分别是吸附前和吸附一段时间后酶解                       备液相色谱分离纯化，手动收集样品中 3 种主要组
            液中主要组分的总质量浓度，g/L；V 是酶解液的体                          分的色谱峰，并将相同组分的色谱峰进行合并，旋
            积，mL；m 0 是大孔吸附树脂的质量，g。                             蒸浓缩后进行真空冷冻干燥，得到橙皮苷、HMG 和
                 解吸率的计算：将上述已吸附至饱和的 0.5  g                      橙皮素单体。
            树脂倒入锥形瓶中，再加入 50 mL 体积分数 45%的                       1.2.8    分离目标组分 HMG 的纯度检测和结构验证
            乙醇水溶液，在 30 ℃恒温水浴摇床上以 200  r/min                        采用 1.2.2 节的高效液相色谱分离条件对目标
            的转速振荡，并定时吸取解吸液用高效液相色谱仪                             组分 HMG 进行纯度检测，并采用紫外可见光谱、
            测定 HMG 等主要组分的含量，由式（2）计算树脂                          红外光谱和 X 射线衍射对制得的 HMG 进行结构验
            对酶解液中主要组分的解吸率。                                     证及鉴定。
                          解吸率   /%   mm   t  1  100          （2）   1.2.9    分离组分的羟基自由基清除活力
            式中：m t 、m 1 分别是解吸一段时间后解吸液中和吸                           采用  Fenton  法 [21] 测定 3 种单体组分橙皮苷、
            附饱和树脂中主要组分的质量，mg。                                  HMG 和橙皮素对羟基自由基的清除能力，在 510 nm
            1.2.5    HPD300 树脂的静态与动态吸附曲线                       处快速测定各样品的吸光值，且对照组不加显色剂，
                 静态吸附曲线：方法同 1.2.4 节，定时吸取酶解                     蒸馏水代替样品组为空白组，V c 作阳性对照。羟基
            液用高效液相色谱仪测定酶解液中橙皮苷、HMG 及                           自由基的清除率可按式（4）计算：
            橙皮素各组分的含量，由式（1）计算 HPD300 树脂                        羟基自由基清除能力/%= [1（A 样品A 对照 ）/A 空白]×100（4）
            对酶解液中各组分的吸附量。
                                                               式中：A 样品、A 对照和 A 空白分别指样品组、对照组和
                 动态吸附曲线：取 1.5 g 预处理过的 HPD300 树
                                                               空白组的吸光值。
            脂进行装柱（Ф1.0 cm×34 cm），用恒流泵以 0.5 mL/min
            的速度连续上样，每 40 min 收集一次流出液，并用                        2   结果与讨论
            高效液相色谱仪测定流出液中 3 种主要组分的质量
            浓度，由式（3）计算 HPD300 树脂对酶解液中主要                        2.1   大孔吸附树脂筛选
            组分的动态吸附量。                                              由图 1 可知，不同类型大孔树脂对酶解液中 3
                                      40
                                         0     i     V  种主要组分的吸附和解吸性能有所不同。从图 1A
                                                               可知，吸附量大小排序是 HPD300  >  DA201-B  >
                     吸附量          /mg / g   i 1      （3）   HPD100 > HPD200A > DM130 > AB-8。而图 1B 中
                                           m 0
            式中：ρ 0 、ρ i 分别是指吸附前和收集的每组酶解液中                      解吸率大小排序是 AB-8>  DM130  >  HPD200A  >
                                                               HPD300 > HPD100 > DA201-B，这与树脂的结构、
            主要组分的总质量浓度，g/L；V 是收集的每组流出液
                                                               极性、比表面积及孔径等因素有关。综合考虑树脂
            的体积，mL；m 0 是指大孔吸附树脂的质量，g。
            1.2.6    HPD300 树脂的洗脱条件优化                          的吸附-解吸性能，优选 HPD300 树脂进行酶解液主
                 准确量取 5  mL 已吸附饱和的 HPD300 树脂装                  要组分的初步纯化。
            柱，先用蒸馏水洗至流出液呈无色，以解吸率为指                             2.2    HPD300 大孔吸附树脂的吸附与解吸性能
            标，进行单因素洗脱实验，考察洗脱剂中乙醇体积                             2.2.1    HPD300 大孔吸附树脂的静态与动态吸附曲线
            分数（15%、30%、45%、60%和 75%）、洗脱剂用量（1~16                    从图 2A 可看出，HPD300 树脂对酶解液中的 3
            BV）以及洗脱流速（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4                  种组分橙皮苷、HMG 和橙皮素的静态吸附量有所不
            和 2.8 mL/min）对解吸率的影响。分别按式（2）计                      同，可能是因为酶解液中各组分的浓度和含量不同，
            算橙皮苷、HMG 和橙皮素 3 种主要组分的解吸率。                         且树脂对 3 种物质的吸附均是先吸附得较快，随后
            1.2.7    半制备液相对酶解液中主要组分的分离纯化                       逐渐平缓。HPD300 树脂对橙皮苷、HMG 和橙皮素
                 半制备液相色谱分离条件：半制备柱 Waters                       的静态吸附量分别为 24.66、18.48 和 5.21 mg/g，即
            C18（19 mm×150 mm×5 μm）；检测波长为 283 nm；               静态条件下总吸附量为 48.35 mg/g。
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