Page 164 - 《精细化工》2020年第11期

·2310· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 37 卷

SCEIX，USA）。 子 B 环 20 位与 21 位的 C—C 单键形成 C==C 双键
1 HNMR：取 3 mg 香叶木苷合成品粉末溶于氘 结构，推断原料物质的量比为 1∶1（即质量比为 1∶
代二甲基亚砜（DMSO-d 6 ）中，以标准化合物四甲 0.4）时，反应式恰好平衡，此时反应物刚好全部转
基硅烷作为内标，密封于核磁管中，用核磁共振波 化为目标产物。
1
谱仪测得核磁共振氢谱（ HNMR）。并与 10 mg
表 1 不同实验条件下目标产物的产率
1
（16.4 mol）香叶木苷标准品 HNMR 进行对照。 Table 1 Product yield under different experimental conditions
1.4 抑癌作用 反应加热 反应时间 m(橙皮苷)∶
1.4.1 细胞培养 序号 温度/℃ /h m(DDQ) 产率/% 纯度/%
复苏实验室冻存的癌细胞株：人结肠癌细胞 1 95 12 1.0∶0.4 28.3 1.2
HT29、人宫颈癌细胞 Hela、小鼠肝癌细胞 Hepa1-6、 2 110 12 1.0∶0.4 66.0 6.8
3 110 6 1.0∶0.1 43.4 7.2
人结肠腺癌细胞 Caco2、人乳腺癌细胞 MCF7、人肝
4 110 6 1.0∶0.4 82.7 8.1
癌细胞 HepG2 6 种，分别分散于 RPMI-1640 细胞培
5 110 6 1.0∶0.8 79.2 7.3
养液中（90% RPMI-1640 培养基+10%胎牛血清+1% 6 110 6 1.0∶1.2 73.3 5.9
双抗，以上百分数均为体积分数），调整细胞浓度 7 110 6 1.0∶1.6 69.6 3.6
5
1×10 个/mL，于 37 ℃，体积分数 5% CO 2 细胞培 8 110 6 1.0∶2.0 68.1 2.3

养箱中静置培养，隔天更换培养液。 由此，最终确定香叶木苷的合成条件为：原料
1.4.2 细胞活性测定 （橙皮苷与 DDQ）质量比为 1∶0.4，反应加热温度
采用 MTT 比色法检测细胞存活情况 [15] 。具体 为 110 ℃（油浴温度），反应时间为 6 h，在此条件
操作为：将已贴壁生长的细胞胰酶消化，调整细胞 下，香叶木苷产率可达 82.7%。
4
浓度为(1~5)×10 个/mL，接种于 96 孔板（100 μL/ 2.2 结构鉴定
孔）培养 12 h，而后更换含有不同质量浓度药物的 采用高效液相色谱技术对纯化后所获产物进行
培养液（终质量浓度：0~300 mg/L），共育 24 h 后， 检测，结果如图 1 所示。由峰面积归一化法计算得
每孔加入 10 μL 质量浓度为 5 g/L MTT 磷酸缓冲液 到产物纯度可达 94.3%。通过与香叶木苷标准品的
(pH 7.4)继续培养 4 h。除去培养液，加入 100 μL 液相谱图比对，该产物保留时间与香叶木苷标准品
DMSO，振荡 10 min，采用全自动酶标仪在 490 nm 保留时间一致。
波长下测定各孔 OD 值(即为 OD 给药组)。以不加药物
进行正常培养的细胞为对照组，以不加药物的培养液
（RPMI-1640+胎牛血清+双抗培养液）为空白组（用
于酶标仪调零）。细胞存活率根据式（2）计算得到：
OD  OD
细胞存活率 /%  给药组 空白组  100 （2）
OD  OD
对照组 空白组

2 结果与讨论

2.1 工艺参数优化
本研究设计 3 个影响因素：反应温度、反应时
间与原料配比,不同实验条件下目标产物的产率列
于表 1。由表 1 可以看出，油浴 110 ℃的回流反应
能够提高产率。推测可能是由于该反应温度已超过
1,4-二氧六环的沸点 101.1 ℃，沸腾回流充分，有助
于反应。据此，本研究确定反应加热温度为 110 ℃。
由表 1 还可看出，110 ℃下，随着反应时间的延长，
产率由 82.7%降低到 66.0%，说明延长反应时间不
利于目标产物的合成，于是本研究选取 6 h 作为后
续合成反应时间。此外，从原料配比看，当橙皮苷
与 DDQ 质量比为 1∶0.4 时，产率最高为 82.7%。 图 1 香叶木苷标准品（a）与合成品（b）的高效液相谱图
Fig. 1 HPLC spectra of diosmin standard sample (a) and
根据 1.2.1 中的转化反应模式，DDQ 氧化橙皮苷分 synthetic product (b)