Page 93 - 精细化工2020年第2期
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第 2 期                      刘   雨，等:  恩施地区野棉花化学成分及其抗肿瘤活性                                  ·295·


            吡喃葡萄糖醛酸齐墩果酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖                         京泰克仪器有限公司；5PX-1505H-Ⅱ恒温培养箱，上
            -(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯（hemsgiganoside B）、常              海新苗医疗器械制造有限公司；SHA-2A 水浴恒温振
            春藤皂苷、3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉                  荡器，金坛市科兴仪器厂；TD5A 台式离心机，河南
            伯糖齐墩果酸 28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃                 北弘实业有限公司；TU-1901 紫外-可见分光光度仪，
            葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯（hederasaponin B）              北京普析通用仪器有限公司；500 型核磁共振波谱仪、
                                                               液质联用仪，中国科学院微生物研究所。
            等；黄酮类化合物，如紫云英苷等；香豆素类化合
                                                               1.2   实验方法
            物，如 4,5-二甲氧基-7-甲基香豆素、4,7-二甲氧基-5-
                                                               1.2.1   化合物分离纯化
            甲氧基香豆素和 4-甲氧基-5-甲基-6,7-二氧亚甲氧
                                                                   称取干燥的野棉花根茎 2 kg，粉碎，用体积分
            基香豆素等及其他类化合物。野棉花作为银莲花属
                                                               数为 70%的乙醇 5000 mL 加热回流提取 3 次，减压
            一类重要的民族药，研究却比较少，现有的文献仅
                                                               蒸馏浓缩提取液得到浸膏。浸膏分散于水中，先用
            对陕西、云南等地区的野棉花进行化学成分研究，                             石油醚萃取除去色素，再分别用乙酸乙酯和正丁醇
            得到了 20 多个皂苷       [3-7] ，包括打破碗花花苷 A、B、
                                                               萃取，萃取相蒸干分别得到浸膏 100、180 g。
            C、D，新木脂素苷〔（7R, 8S）-愈创木基甘油-8-O-4′-
                                                                   乙酸乙酯萃取浸膏用甲醇溶解后，加入适量硅
            芥子醇基醚-9′-  O-β-D-葡萄糖苷〕等。湖北恩施地                      胶拌成干样，加入到硅胶层析柱中（柱高 25 cm，内
            区有着丰富的野棉花资源，但尚未见研究报道，这                             径 3 cm），石油醚-乙酸乙酯（体积比为 1∶1）洗脱，
            在一定程度上限制了恩施地区野棉花资源的深度                              经薄层色谱硅胶板检测合并，得到 2 个组分，记为
            挖掘。                                                Fr1 和 Fr2。
                 为了进一步完善银莲花属植物化学成分的研                               Fr1 组分制备液相分离，洗脱条件为体积分数
            究，特别是非五环三萜类成分，并对湖北恩施地区                             30%的甲醇水溶液等度洗脱，洗脱时间为 30 min，得
            野棉花药材活性物质进行探究，本文拟以采自湖北                             到化合物Ⅰ（20 mg），化合物Ⅱ（18 mg）。Fr2 采
            恩施自治州地区的野棉花为原材料，用体积分数                              用 Sephadex LH-20（柱高 110 cm，内径 2 cm）分离，
            70%的乙醇溶液加热回流提取得到浸膏，采用硅胶、                           甲醇洗脱，得到化合物Ⅲ（8 mg）。
            Sephadex LH-20、制备液相等色谱方法对其化学成                          正丁醇萃取浸膏用甲醇溶解后，加入适量硅胶
            分进行分离，运用理化性质和核磁共振氢谱和碳谱、                            拌成干样，加入到硅胶层析柱中（柱高 25 cm，内
            质谱等方法进行结构鉴定，并用四唑盐（MTT）法                            径 3 cm）。用乙酸乙酯-甲醇（体积比为 9∶1）洗脱，
            对分离鉴定的化合物进行抗肿瘤活性筛选得到活性                             经薄层色谱硅胶板检测合并，得到 3 个组分，分别
            物质，为恩施地区的野棉花资源开发利用提供理论                             记为 Fr3、Fr4、Fr5。
            研究基础。                                                  Fr3 组分制备液相分离，洗脱条件为体积分数
                                                               30%的甲醇水溶液等度洗脱，洗脱时间为 40 min，得
            1   实验部分
                                                               到化合物Ⅳ（12 mg）、化合物Ⅴ（10 mg）和化合物
            1.1   材料、试剂与仪器                                     Ⅵ（7 mg）。
                 宫颈癌细胞 HeLa、人血管内皮细胞 VE，武汉大                         Fr4 组分制备液相分离，洗脱条件为体积分数
            学提供；顺铂、MTT、二甲基亚砜（DMSO），美国                          25%的甲醇水溶液等度洗脱，洗脱时间为 40 min，得
            Sigma 公司；色谱纯甲醇，天津科密欧公司；超纯水，                        到化合物Ⅶ（20 mg）、化合物Ⅷ（15 mg）和化合物
            自制；体积分数 95%乙醇（医用）、甲醇、乙酸乙酯、                         Ⅸ（9 mg）。
            石油醚，中国医药集团总公司；药材于 2016 年 10 月                          Fr5 组分制备液相分离，洗脱条件为体积分数
            采自湖北省恩施自治州，经湖北民族大学王发松教授                            5%的甲醇水溶液等度洗脱，洗脱时间为 40 min，得
            鉴定为毛茛 科银莲花属 植物野棉花 （ Anemone                        到化合物Ⅹ（20 mg）。
            vitifolia.），标本保存于生物资源保护与利用湖北省重                     1.2.2   化合物抗肿瘤活性测试
            点实验室。                                                  参照文献[8]的方法，采用 MTT 法对化合物抗
                 柱色谱硅胶（100~200 目和 200~300 目）、薄层                肿瘤活性进行测试。分别将处于对数期的宫颈癌细
            色谱硅胶板，青岛海洋化工公司；96 孔板，常德比克                          胞 HeLa 和人血管内皮细胞 VE 用胰蛋白酶消化液使
            曼生物科技有限公司；LC-20AR 半制备液相色谱仪                         其脱落，制成细胞悬液，将细胞悬液接种于 96 孔板，
            （C 8，10 mm×250 mm×5 μm），日本岛津公司；RE-                 6000 个/孔，待测化合物为 10、100  μmol/L 两个浓
            2000A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；三用紫外                         度，每个浓度设 3 个孔，并设空白对照和阳性对照，
            仪，杭州齐威仪器有限公司；X-6 显微熔点测定仪，北                         阳性对照药品为顺铂。在 37  ℃培养 24 h 后，向每
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