Page 139 - 《精细化工》2020年第4期

第 4 期 杨林玉，等: 兼性离子修饰亲水磁珠固定化谷胱甘肽-S-转硫酶 P1 及其表征 ·773·

beads was stirred in PBS (pH 6.5) at 0 ℃ for 8 h and did not show obvious change in activity, while the
free enzyme activity decreased about 20%. After it was further treated with methanol at 80 ℃ for 20 min,
negligible protein was released. There was no significant difference in IC 50 of ethacrynic acid (EA) between
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hGSTP1 immobilized by Ni -NTA magnetic beads and free enzyme (P>0.05). Therefore, the immobilized
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hGSTP1 by Ni -NTA magnetic beads is suitable for affinity-drive-exponential-enrichment of hGSTP1
inhibitors in the mixture for screening.
Key words: glutathione-S-transferase; immobilization; magnetic beads; mixture screening; drug materials

谷胱甘肽-S-转硫酶（glutathione-S-transferases， 可通过与蛋白游离氨基形成酰胺键而固定化，但选
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GSTs）可催化还原型谷胱甘肽（γ-L-glutamyl-L- 择性较低 [16] ；Ni -NTA 磁珠可选择性固定组氨酸融
cysteinylglycine，GSH）与内源性或外源性亲电性物 合表达标签，而尽可能减少对靶蛋白的影响 [17] ，但
[1]
质结合 ；根据序列同源性将细胞质内的 GSTs 分为 稳定性对 pH 等敏感。本实验融合表达 N 端带 6×His
[2]
7 个亚类—α、μ、ω、π、σ、ζ、Σ ，有不同组织分 标签 hGSTP1 二聚体，经两种方法纯化后，比较两
布。GST 同工酶 π（GST isozyme pi，GSTP）在多 种兼性离子修饰磁珠固定化，以期获得磁珠固定化
种肿瘤及癌前病变组织中显著过表达 [3-4] ，与不同肿 hGSTP1 用于 ADEE 筛选抑制剂混合物。
[5]
瘤细胞化疗药物敏感性及耐药性有关 ，且与凋亡
1 实验部分
相关信号蛋白 JNK、ASK 结合从而参与肿瘤细胞凋
亡 [6-7] 。GSTP 选择性抑制剂有望成为肿瘤细胞耐药
1.1 试剂与仪器
增敏剂以及研究 GSTP 耐药机制的工具试剂。活性
谷胱甘肽（GSH），分析纯，北京鼎国生物技术
GSTP 为二聚体，依他尼酸（Ethacrynic acid，EA）
有限公司 ；异丙 基 硫 代 -β-D- 半乳 糖苷
是经典的 GST 非选择性单价抑制剂，但亲和力有 （Isopropyl-β-D-hiogalactoside，IPTG），分子生物学
[8]
限 。将两个 EA 通过 3,5-二氨甲基苯甲酸的二氨基
级， E.coli BL21 (DE3) 、 4- 羟乙基 哌嗪乙磺酸
以酰胺键连接后，可以制备同时结合 GST 二聚体双 〔2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl] ethanesulfonic
[9]
活性中心及连接狭缝的高亲和力二价抑制剂 。进
acid，HEPES〕，分析纯，生工生物工程（上海）股
一步优化连接臂及单价抑制剂结构可望获得高亲和
份有限公司；依他尼酸（EA），分析纯，GSH-Sepharose
力且具有耐药增敏活性的先导配体。目前发现高亲 2+
4B，Sigma-Aldrich 公司；Ni -NTA 琼脂糖树脂，南
和力先导配体常用纯化合物库进行高通量筛选，其 京金斯瑞生物科技有限公司；Ni -NTA 磁珠（批号
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制库成本高且效率低。借助组合合成制备结构多样 20170714，100 g/L）、F1 羧基磁珠（Carboxyl magnetic
性的混合物库再筛选 [10] ，或从天然产物混合物中直 submicron particles F1，MSP-COOH-F1，30 g/L），
接筛选有望高效发现活性先导配体 [11] ，但此类混合 重庆博蓝鹰生物技术有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺
物成分未知或高亲和力配体丰度极低。因此，如何 （ NHS ）、 1-(3- 二甲氨基 丙基 )-3- 乙 基碳二亚胺
从此类混合物中高效发现极低丰度、高亲和力配体 （EDC）、硫酸卡那霉素、二亚乙基三胺五乙酸
仍是挑战。 （DETAPA）、2-吗啉乙磺酸（MES）、1-氯-2,4-二
课题组前期建立亲和力驱动的指数富集技术 硝基苯（CDNB），分析纯，东京化成工业株式会
（Affinity Driven Exponential Enrichment，ADEE） 社。所有溶液均用 Millipore 纯水系统处理的 ddH 2 O
筛选混合物策略 [12-13] 。采用非特异结合低的磁珠固 配制。
定蛋白并尽可能保留其活性，已获得兼性离子修饰 UV-2500 紫外可见分光光度计，日本岛津公司；
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的亲水性羧基磁珠和 Ni -NTA 磁珠，证明其残留小 QB-9001 快速振荡器，江苏其林贝尔仪器制造有限
分子和非特异吸附量都很低 [14-15] 。应用此兼性离子 公司；12 孔磁分离架，美国 Promega 公司；Amicon
修饰亲水磁珠，针对不同药靶，优化固定化方案， Ultra-15，PLHK Ultracel-PL 超滤管（10 kDa），美
实现靶蛋白大量可溶性表达及在磁珠表面高保留酶 国 Millipore 公司。
活固定化，可望应用于 ADEE 发现组合合成混合物 1.2 方法
或天然产物混合物中含量未知或极低丰度、高亲和 1.2.1 6×His-hGSTP1 质粒构建
力的配体。hGSTP1 易于经大肠杆菌融合表达后用 构建 N 端带 6×His 标签的质粒。编码序列
GSH-Sepharose 4B 层析柱纯化或 N 端带 6×His 标签 hGSTP1（GI:4504183），编码基因全合成后插入
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hGSTP1 用 Ni -NTA 层析柱纯化制备，但其固定化 pET28a（+）载体（全长编码序列和载体构建由中
需避免二聚体和狭缝的空间结构被破坏。羧基磁珠 美泰和生物技术有限公司完成）。