Page 140 - 《精细化工》2020年第4期

·774· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 37 卷

1.2.2 6×His-hGSTP1 表达及不同方法纯化 度法 [20] 检测活性。
质粒转化至感受态 E. coli BL21（DE3）培养， 1.3 磁珠固定化及其表征
单克隆测序鉴定。37 ℃，180 r/min，250 mL LB 培 1.3.1 羧基磁珠活化及蛋白固定化
养基中扩大培养至 OD 600 =0.6 左右，加入终浓度 羧基磁珠的活化按照重庆博蓝鹰生物技术有限
1 mmol/L 的 IPTG，16 ℃，110 r/min 诱导表达 18 h。 公司推荐方案进行（http://www.fbdbio.com/html/cpzx/
4 ℃，5000 r/min 离心收集菌体。 jjcz/）。取 3.3 mg 羧基磁珠到 2 mL 离心管中，磁分
2+
Ni -NTA 层析柱纯化：菌体重悬于 50 mL 离弃上清，预冷 20 mmol/L MES 缓冲液（pH 6.0）
0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L HEPES 缓冲液（pH 200 μL 剧烈涡旋振荡洗涤 3 次。磁分离弃上清，依
8.0），4 ℃超声破菌 10 min（超声振幅 29%，工作 次迅速加入 25 g/L NHS 溶液和 25 g/L EDC 溶液各
时间 4 s，间隔 6 s），12000 r/min 离心 30 min，分离 100 μL，剧烈涡旋振荡混匀，在四维混合仪上持续
2+
收集上清。10 mL Ni -NTA 填料加入至内径 10 mm、 25 ℃混合反应 30 min。磁分离弃上清，预冷 MES
高度 20 cm 层析柱中，加入上清，控制结合速度， 缓冲液洗涤 2×200 μL 重悬至 6 g/L。
先用 300 mL 30 mmol/L 咪唑洗杂，再用 30 mL 将 600 μg 活化磁珠悬液 100 μL 转移到预冷
500 mmo/L 咪唑洗脱，收集洗脱液。 100 μL 不同浓度 6×His-hGSTP1 中，轻柔振荡混匀，
GSH-Sepharose 4B 层析柱纯化参照文献[18]进 冰水浴条件下 180 r/min 振摇偶联 30 min。其余磁珠
行。先用 300 mL 含 0.15 mol/L NaCl，100 mmol/L 用预冷 MES 缓冲液洗涤 3×200 μL。加入反应缓冲
PBS 缓冲液洗杂，再用 30 mL 含有 20 mmol/L GSH， 液重悬至 1 g/L。
2+
100 mmol/L PBS 缓冲液洗脱。 1.3.2 Ni -NTA 磁珠固定化
2+
洗脱液加入 Millipore Amicon Ultra-15，PLHK 取150 μg Ni -NTA 磁珠，磁分离弃上清，20 mmol/L
Ultracel-PL 超滤管，用 100 mmol/L PBS（磷酸缓冲 PBS 缓冲液（pH 7.0）200 μL 洗涤 3 次，20 mmol/L
盐溶液，pH 8.0）超滤 3 次，每次 20 mL，最后浓缩 PBS 缓冲液（pH 8.0）重悬至 50 μL，分批加入 50 μL
至 500 μL。Bradford 法 [19] 测蛋白浓度；质量分数 15% 不同浓度 6×His-hGSTP1 蛋白液中，冰水浴条件下
SDS-PAGE 分析蛋白纯度；蛋白溶液在–80 ℃保存。 180 r/min 振摇偶联 30 min，用 20 mmol/L PBS 缓冲
1.2.3 6×His-hGSTP1 活性测定 液（pH 8.0）洗涤 3×200 μL。磁分离弃上清，加入
活性测定按照 Habig 法 [20] 。25 ℃，反应体系为 反应缓冲液重悬磁珠至 0.1 g/L。
含有 0.5 mmol/L DETAPA 的 100 mmol/L PBS（pH 1.3.3 磁珠固定化容量测定
6.5）缓冲液 1 mL，加入新鲜配制的 GSH 和 CDNB 在固定磁珠量条件下，逐渐增大蛋白用量，设
溶液到终浓度 1 mmol/L，最后加入适当稀释的蛋白 置加入对应蛋白量的不含磁珠对照组。磁分离吸取
液，摇匀后延迟 10 s，每隔 10 s 记录 340 nm 处吸光 上清用 Bradford 法 [19] 测定上清剩余蛋白量；对照组
度的变化，共记录 90 s。取线性变化范围内的速度 和上清之间的蛋白量之差即磁珠固定量。作固定量
（ΔA/min）作为初始反应速度（V），按设定的产物 与蛋白用量的响应曲线，直至固定量达到定值即为
S-(2,4-二硝基苯基)-谷胱甘肽（GS-DNB）消光系数 饱和固定量。饱和固定时每 g 磁珠固定化蛋白量近
〔ε=9600 L/(mol·cm)〕计算酶活力，1 min 内生成 似为饱和固载蛋白量。
1 μmol 产物所需酶量计为一个活力单位。 1.3.4 光度法连续跟踪酶反应过程测定磁珠固定化
1.2.4 6×His-hGSTP1 对 GSH 和 CDNB 的 K m 6×His-hGSTP1 保留活性
采用初速度法 [20] 测定 6×His-hGSTP1 对不同底 测定体系和游离酶一致。取 50 μg 羧基磁珠固
2+
物的米氏常数（K m ）。在 1 mL 反应体系中，有机溶 定 6×His-hGSTP1 或 6 μg Ni -NTA 固定 6×His-
剂质量分数 控制在 5% 以下。 CDNB 的终浓度 hGSTP1 加入反应体系。延迟 10 s 后每隔 10 s 记
1 mmol/L，变化 GSH 浓度；GSH 的终浓度 1 mmol/L， 录 340 nm 处吸光度的变化，共记录 90 s，用固定化
变化 CDNB 的浓度。取线性变化范围内的速度 酶与等量游离酶比活之比，表示磁珠固定化酶保留
（ΔA/min）的倒数作为纵轴（1/V），变化底物浓度 活性。
的倒数（1/c）做横轴，再用双倒数作图法 [21] 分别测 1.3.5 磁珠固定化和游离 6×His-hGSTP1 在筛选应
定 6×His-hGSTP1 对 GSH 和 CDNB 的 K m 。 用下酶活稳定性
1.2.5 6×His-hGSTP1 的 pH 效应 取固定化酶和游离酶，于 0 ℃，100 mmol/L PBS
2+
配制不同 pH 缓冲液（5.0~8.0），低于 pH 5.8 （pH 6.5）缓冲液中振摇，每隔 2 h 取 6 μg Ni -NTA
使用 100 mmol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液，高于 pH 8.0 固定化酶及其分离上清和 0.25 μg 游离酶测其活性，
使用 100 mmol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，用初速 连续检测 8 h。