Page 141 - 《精细化工》2020年第4期

第 4 期 杨林玉，等: 兼性离子修饰亲水磁珠固定化谷胱甘肽-S-转硫酶 P1 及其表征 ·775·

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1.3.6 Ni -NTA 磁珠固定化对筛选及后处理条件
的稳定性
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筛选过程中，Ni -NTA 磁珠固定化酶在冰浴条
件下 180 r/min 振荡 1 h，磁分离取上清后加甲醇
80 ℃处理 20 min，分离磁珠和上清，甲醇样品用
N 2 挥干。设置相同蛋白量游离酶作为对照。磁珠和
甲醇样品分别加入 20 μL PBS 缓冲液和 5 μL 5×
Loading buffer，沸水浴 10 min 完全变性蛋白。利用

15%（溶液中聚丙烯酰胺的质量分数）SDS-PAGE， M—Maker；1—沉淀；2—粗酶；3—Ni -NTA 层析柱穿透液；

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每个孔道均加入等体积样品，90 V，30 min 后改变 4—Ni -NTA 层析柱洗杂； 5—Ni -NTA 层析柱纯化 6×His-
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至 120 V，2 h。考马斯亮蓝染色后脱色观察。 hGSTP1；6—GSH-Sepharose 4B 层析柱纯化 6×His-hGSTP1

1.3.7 磁珠固定化酶对抑制剂 EA 的响应 图 1 SDS-PAGE 检测 6×His-hGSTP1 的纯化
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于 1.0 mL 反应体系，分别加入 6 μg Ni -NTA Fig. 1 SDS-PAGE analysis of 6×His-hGSTP1 after purification
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by Ni -NTA and GSH-Sepharose 4B columns
固定化酶，0.25 μg 游离酶，与不同浓度 EA 混匀孵

育 3 min，加入底物测定酶活。用 OriginPro 8.5 拟合
抑制率对 EA 浓度对数响应，确定 EA 对游离酶和固
定化酶的 IC 50 。
1.4 数据处理方法
实验独立重复测定 3 次，结果表示为平均值±
标准偏差（ x  ）；用 OriginPro 8.5 进行数据处理，
s
统计学处理采用 SPSS 20.0，P<0.05 为差异有统计
学意义。

2 结果与讨论

2.1 6×His-hGSTP1 的表达和纯化
GSH 是 GST 的固有底物，通常可用 GSH-
Sepharose 4B 选择性结合后，用高浓度 GSH 洗脱目
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的蛋白；而融合表达 6×His-hGSTP1 可用 Ni -NTA
层析柱纯化。如图 1 所示，融合表达所得 6×His-
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hGSTP1 分别用 GSH-Sepharose 4B 层析柱和 Ni -
NTA 层析柱纯化均可获得纯度较高的蛋白，SDS-

PAGE 显示均得到相对分子质量约 26 kDa 的单体。
图 2 GSH(a)和 CDNB(b)的表观 K m
GSH-Sepharose 4B 层析柱纯化 6×His-hGSTP1 比活 Fig. 2 K m of GSH (a) and CDNB (b)
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约为（89.5±5.2）kU/g，Ni -NTA 层析柱纯化蛋白
比活约为（87.2± 4.8）kU/g，二者无明显差异。 2.3 两种方式纯化所得 6×His-hGSTP1 pH 效应
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2.2 Ni -NTA 层析柱纯化所得 6×His-hGSTP1 的 K m 如图 3 所示，虽然引入了 6×His 标签，但是两
固定 CDNB 终浓度为 1 mmol/L，改变 GSH 浓 种纯化方式所得酶最适 pH 均在 6.5 附近，与文献报
度测定 6×His-hGSTP1 对底物的表观 K mGSH 为（0.3± 道未带标签的 hGSTP1 一致 [20] 。最适 pH 即活性最
0.1） mmol/L（图 2a）。固定 GSH 终浓度为 1 mmol/L， 高 pH，其主要受活性相关氨基酸残基和底物的解离
改变 CDNB 浓度测得 6×His-hGSTP1 对底物表观 性质影响，而 6×His 标签的引入远离活性中心，对
K mCDNB 为（1.5±0.4）mmol/L（图 2b）。两种方法纯 活性中心的氨基酸残基和底物解离影响较小。故
化所得 6×His-hGSTP1 对底物表观 K m 没有显著性差 6×His 标签的引入对 6×His-hGSTP1 的最适 pH 影响
异 [22] 。6×His 标签的引入对比活和底物亲和力未见 较小，所得 6×His-hGSTP1 固定化后可用 pH 6.5 缓
明显影响，故可作为靶酶固定化。 冲液筛选。