Page 142 - 《精细化工》2021年第1期
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·132·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 38 卷

            6、8、10、11）以及反应时间（10 min、30 min、                    2 个加药组（桑叶水提物和桑叶银纳米粒）、阳性组
            1 h、2 h、4 h、6 h 和 12 h）对桑叶银纳米粒形成的                  （紫杉醇）；药物质量浓度为 6.25、12.5、25、50、
            影响   [21] 。                                        100、200 mg/L。每个浓度 3 个平行孔，于细胞培养
            1.2.3   验证实验                                       箱中培养 48 h   [28] 。弃去每孔的上清液，再加入 50 μL
                 取 3 等份桑叶水提液，分别将 pH 调至 11.0，                   的 2 g/L 的 MTT 溶液，于细胞培养箱中培养 4 h，
            按桑叶水提液与 AgNO 3 溶液体积比 1∶5，边搅拌边                      然后完全弃去每孔的上清液后再在每孔加入 150 μL
            将桑叶水提液滴入 5.0 mmol/L AgNO 3 溶液中，将反                  的 DMSO，于培养箱中反应 30 min 后测定其在
            应温度控制为 35  ℃，避光搅拌反应 6 h 后，测定反                      490 nm 处的吸光度。细胞存活率的计算公式为：
            应溶液在 300~600 nm 范围内的紫外吸收光谱               [22] 。               细胞存活率/%=A 样品/A 空白组×100
            1.3    银纳米粒表征                                      式中：A 样品指被测样品的吸光度值，A 空白组指空白不
                 分别取适量的桑叶银纳米粒反应溶液以及桑叶                          加药组的吸光度值。
            水提液于比色皿中，用蒸馏水进行空白校正，然后
            测定它们在 300~600 nm 范围内的紫外吸收光谱                [23] 。   2    结果与讨论
                 将少量干燥后的桑叶银纳米粒分散于粘有导电
                                                               2.1   桑叶银纳米粒制备条件优化
            胶的扫描电镜样品台上，喷金，然后拍照观察纳米
                                                               2.1.1  AgNO 3 浓度对桑叶银纳米粒形成的影响
            粒的形貌；同时用扫描电镜自带的能谱仪测定纳米                                 图 1 为不同考察因素对桑叶银纳米粒形成的影
            粒的元素组成       [23] 。                                响。紫外可见光下，金属纳米粒中的电子会发生集
                 将桑叶银纳米粒分散在蒸馏水中，超声 30 min                      体振荡而产生特征性的表面等离子体共振（SPR）
            后用 0.45 μm  的微孔滤膜过滤，然后用动态光散射                       吸收峰   [29] 。银纳米粒在 350~500 nm 内有表面等离
            仪测定纳米粒水溶液状态下的粒径大小、多分散指                             子体共振最大吸收峰，而且最大吸收峰的波长与银
            数（PDI）及 Zeta 电位      [24] 。
                                                               纳米粒的粒径有关，其吸收强度和银纳米粒的含量
                 桑叶水提液冷冻干燥得到干燥的桑叶水提物粉                          有关  [30] 。图 1a 显示，实验方法同 1.2.1 节时，随着
            末，然后分别测定干燥水提物粉末和桑叶银纳米粒                             AgNO 3 浓度的增大，银纳米粒的最大吸收强度逐渐
                          –1
            在 400~4000 cm 范围内的 FTIR 谱图        [24] 。           增强，表明银纳米粒产量逐渐增多；而当 AgNO 3 浓
            1.4   桑叶银纳米粒抗菌抗癌活性                                 度为 10.0 mmol/L 时，最大吸收波长发生红移。这
            1.4.1   桑叶银纳米粒抗菌活性
                                                               是由于桑叶水提液用量一定的情况下，随着 AgNO 3
                 首先，将受试菌种活化          [25] ，用无菌水将活化后            浓度的增加，更多的 Ag 被还原成小的纳米粒子并
                                                                                     +
                                        6
            的受试菌种浓度均调至约 1×10  CFU/mL。然后分别                      被桑叶中有机化合物吸附稳定；当 AgNO 3 溶液浓度
            将调好浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假                             进一步增加至过量时，桑叶中有机稳定剂成分被消耗
            单胞杆菌以及枯草芽孢杆菌菌液均匀地涂布于 MH                            完后银纳米粒子会发生聚集形成较大的纳米粒子                     [20] 。
            琼脂平板上；将调好浓度的白色念球菌菌液均匀地                             因此，AgNO 3 溶液浓度对银纳米粒的产量和粒径大
            接种于 YM 琼脂平板上。用打孔器在每个涂有菌种                           小均有影响。所以，当 AgNO 3 浓度为 5.0 mmol/L
            的琼脂平板上打出 3 个分布均匀的小孔（直径约                            时生成的银纳米粒较多同时粒径保持不变，故选择
            6.0 mm）。分别将 50  μL 质量浓度均为 100 mg/L 的               AgNO 3 浓度为 5.0 mmol/L。
            桑叶水提物、桑叶银纳米粒和阳性药加入到涂有受                             2.1.2   反应温度对桑叶银纳米粒形成的影响
            试菌种的琼脂平板上的小孔中。其中，头孢克肟以                                 图 1b 显示，实验方法同 1.2.1 节时，随着温度
            及氟康唑分别作为细菌和真菌的阳性对照药。将加                             的升高，最大吸收波长先基本保持不变，当温度升
            完样品的 MH 平板放在 37  ℃恒温培养箱培养 24 h，                    到 65 ℃时最大吸收波长发生红移，说明只有温度较
            将加完样品的 YM 平板放至 28  ℃恒温培养箱培养                        高的情况下银纳米粒粒径才会发生变化；随着温度
            48 h [26] 。取出平板，分别测量抑菌圈直径大小，平                      升高，最大吸收强度发生明显变化，说明温度对银
            行实验 3 次，取平均值。                                      纳米粒产量影响较大。当温度为 35  ℃时，吸收强
            1.4.2   桑叶银纳米粒抗癌活性                                 度明显增强，说明 35  ℃时银纳米粒产量明显增多，
                 经培养后    [27] ，分别收集长势良好的乳腺癌、肝                  故选择制备银纳米粒的最适温度为 35  ℃。温度升
                                                                                                 +
            癌和宫颈癌细胞并在显微镜下计数，用 DMEM 完全                          高会加速桑叶中还原性成分还原 Ag 成银核的过
                             4
            培养基稀释成 1×10 个细胞/孔，分别取 100 μL 的细胞                   程，如果温度过高还原速度过快以至稳定性成分来
            混悬液加入到无菌 96 孔板中于细胞培养箱中培养                           不及吸附在粒子表面，使粒子发生聚集形成较大粒
            24 h 至细胞贴壁后加药处理。设置空白组（DMEM）、                       子；同时，高温容易破坏有机物与纳米粒子间的吸
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