Page 95 - 《精细化工》2021年第6期

第 6 期 靳玉慎，等: pH 敏感的 PLGA 包覆 Ag 2 S 团簇用于近红外Ⅱ区荧光引导的肝癌手术切除 ·1157·

使分散液中的氯仿挥发掉。得到的纳米团簇用去离 育 4 h 后将未摄取的纳米粒子去除换上新鲜的培养
子水洗涤 3 次，并重新分散到磷酸盐缓冲液（PBS， 基，继续培养不同时间（12、24、48、72 h）后通过
pH 7.4）中，得到了装载 Ag 2S 的 PLGA（PLGA@Ag 2S） 流式细胞仪（12 孔板）进行细胞荧光测定，通过激
纳米粒子。 光共聚焦显微镜（共聚焦小皿）进行图像采集并进
通过 EDC 和 NHS 活化 PLGA@Ag 2S 纳米粒子 行数据分析，以分析纳米粒子的摄取以及降解过程。
表面的羧基（三者物质的量比为 10∶10∶1），然后 1.4.3 体外检测纳米粒子的细胞毒性
室温下加入 1 mg（0.64 µmol）靶向多肽 SP94 继续 将近红外Ⅱ区荧光探针与人脐静脉上皮细胞
搅拌反应 24 h，其中，靶向多肽 SP94 与 PLGA@Ag 2 S HUVEC 以及肝脏正常细胞 LO2 细胞共孵育不同时
物质的量比为 20∶1，反应完成后，置于透析袋（截 间后，通过 MTS 实验检测探针的细胞毒性 [21] 。2×10 4
4
4
留相对分子质量为 1.2×10 ~1.4×10 Da）中透析 个细胞/孔接种于 96 孔板，在细胞培养箱中贴壁培
24 h，得到靶向多肽 SP94 修饰的 PLGA@Ag 2 S 养 24 h 后，将培养基更新为含有不同质量浓度的纳
（SP94-PLGA@Ag 2 S）纳米粒子，如图 1 所示。 米粒子（0、5、10、50、100、500、1000 mg/L）与

细胞共同孵育 24、48 或 72 h。然后用 PBS 7.4 缓冲
液反复冲洗细胞 3 次后，将培养基换成新鲜培养基，
并加入 MTS 试剂与细胞共孵育 1~4 h，使用酶标仪
测定其在 490 nm 处吸光度，每个样品每次实验设
置 5 个复孔。细胞存活率按式（1）进行计算：

A 实验组  A 空白组
图 1 SP94-PLGA@Ag 2 S 纳米粒子的构建及酸性条件下 /%  细胞存活率 A 对照组  A 空白组  100 （1）
的降解
Fig. 1 Fabrication of SP94-PLGA@Ag 2 S nanoparticles 式中：A 实验组为纳米粒子与细胞共孵育组；A 空白组为
and their degradation in acid environment 既无细胞也无纳米粒子组；A 对照组为只有细胞不加纳
米粒子组。
1.3 SP94-PLGA@Ag 2S 纳米粒子的表征及性能测试
1.5 体内近红外荧光Ⅱ区成像实验
采用 TEM 表征纳米粒子的微观结构，加速电压
1.5.1 体内成像
为 100 kV；通过激光动态粒度仪测试纳米粒子的水 将 1×10 个 HepG2 肝癌细胞接种在 Balb/C 小鼠
6
o
合粒径分布，散射角为 90 ，波长为 632.8 nm；利用
皮下组织；在细胞移植后第 7、10 和 15 d 观察皮下
荧光分光光度计对纳米粒子光谱特性进行测试，激
瘤的生长状况。在动物模型构建成功后，将纳米粒
发波长 800 nm，狭缝为 5 nm。
子（质量浓度为 7.5 g/L, 注射剂量为 100 µL）进行
1.4 SP94-PLGA@Ag 2 S 纳米粒子的体外表征
尾静脉注射到荷瘤小鼠体内后在不同时间点进行近
1.4.1 肿瘤细胞培养
红外Ⅱ区成像，用于观测探针在体内的动态分布。
采用的细 胞系主要 是人脐静 脉上皮细胞
1.5.2 近红外Ⅱ区荧光引导的手术切除
HUVEC，肝癌细胞 HepG2 和人正常肝细胞 LO2 细
在最佳成像时间点，在近红外Ⅱ区荧光引导下
胞系，均培养在 DMEM 培养基（Dulbecco's modified
进行皮下肿瘤的切除，并以空白对照组（不进行任
Eagle medium）（含有体积分数为 10%胎牛血清），
何手术）和传统手术组作为对照，在手术结束后观
体积分数为 5% CO 2 ，37 ℃环境中。待细胞汇合度
察小鼠肿瘤的生长情况、体重变化情况以及小鼠的
达到 80%~90%时，细胞通过质量浓度为 2.5 g/L 胰
生存率，以评估近红外Ⅱ区荧光引导手术的有效性
酶 PBS 7.4 缓冲液（磷酸盐缓冲液）消化，之后重
以及生物安全性。
新培养在 DMEM 完全培养基中用于连续实验。
相关的动物实验操作规范均获得北京大学实验
1.4.2 体外检测肿瘤细胞对纳米粒子的摄取及纳米
动物伦理委员会的批准，符合动物伦理道德规范。
粒子的细胞内降解
待细胞汇合度达到 80%~90%时，细胞在质量 2 结果与讨论
浓度为 2.5 g/L 胰酶 PBS 7.4 缓冲液于 37 ℃下消化
2~5 min，然后加入完全培养基终止消化并计数。按 2.1 SP94-PLGA@Ag 2 S 纳米粒子的表征
照一定的密度将细胞铺在 12 孔板或共聚焦小皿中， 通过共沉淀法和化学偶联技术制备了 SP94-
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细胞最终密度为 1×10 个细胞/孔（皿）。待细胞过 PLGA@Ag 2S 纳米粒子，对新制备的 Ag 2S 和 SP94-
夜贴壁后，将培养基换成质量浓度为 100 mg/L 装载 PLGA@Ag 2S 纳米粒子进行了 TEM、荧光光谱及粒
异硫氰酸荧光素（FITC）的近红外Ⅱ区荧光探针，孵 径表征，结果见图 2。