Page 168 - 《精细化工》2021年第8期

·1662· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 38 卷

434.2103。 紫外光谱仪扫描范围 400~800 nm，荧光光谱仪激发
探针 TC-BOR：将化合物 TC-OH（50 mg， 波长设置为 λ ex = 690 nm，扫描波长范围为 700~
0.12 mmol）、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯（70 mg， 850 nm，狭缝宽度为 5.0 nm。依次进行紫外-可见光
0.24 mmol）和 K 2 CO 3 （72.6 mg，0.53 mmol）溶于 谱测试、荧光光谱测试、最佳响应时间测试、pH 的
DMF（10 mL），室温反应 12 h。反应结束后，倒入水 影响测试（PBS 的 pH = 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、
中，用二氯甲烷萃取（3×15 mL），合并有机相，用 7.4、8.0、9.0、10.0 以及 11.0）、浓度梯度测试（H 2 O 2
饱和氯化钠洗涤，减压蒸馏，残余固体采用硅胶层 溶液终浓度分别为 0、10、100、200、300、400、
析柱色谱分离法分离提纯〔V(二氯甲烷)∶V(甲醇) = 500、700 以及 1000 μmol/L）以及选择性测试（离
20∶1〕，得到蓝黑色固体粉末化合物Ⅵ（TC-BOR） 子溶液终浓度为 1.0 mmol/L，小分子及活性物种终
1
32 mg，收率 35%。 HNMR (500 MHz, CDCl 3 )，δ： 浓度为 50 μmol/L）。
8.71 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.02 1.3.3 MTT 细胞毒性测试
(dd, J = 12.8、8.6 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.70 采用 MTT〔3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二
(dd, J = 15.5、8.1 Hz, 2H), 7.57 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 苯基四氮唑溴盐〕法 测定探针 TC-BOR 的浓度与
[5]
7.51 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.14 作用时间对细胞存活率的影响。在 96 孔板上加入
(s, 1H), 6.93 (d, J = 10.3 Hz, 2H), 6.63 (d, J = 15.0 Hz,
1H), 5.28 (s, 2H), 4.22 (s, 3H), 2.82 (dd, J = 29.1、 HeLa 细胞（4000 个/孔），置于 37 ℃、含体积分
23.5 Hz, 4H), 2.06 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 1.95 (d, J = 数 5%的 CO 2 、相对湿度 100%的细胞培养箱中孵育
13
5.4 Hz, 2H), 1.32 (s, 12H); CNMR (126 MHz, DMSO- 24 h。随后分别加入终浓度为 0 和 10 μmol/L 的
d 6 )，δ：179.18, 161.07, 159.46, 153.56, 143.79, 139.82, TC-BOR 孵育适当时间。接着，每孔加 50 μL 的 MTT
139.68, 135.68, 134.65, 132.32, 131.99, 130.59, 溶液〔V(MTT 原液)∶V(PBS 缓冲液，pH = 7.4) =
130.04, 128.76, 128.08, 127.08, 126.93, 126.05,
122.54, 115.52, 113.60, 113.21, 112.55, 104.77, 1∶4〕再孵育 4 h 使 MTT 还原为蓝紫色晶体甲臜，
101.91, 83.69, 69.95, 51.98, 33.22, 28.43, 26.88, 24.62, 吸出上层清液，加入 150 μL DMSO 使甲臜溶解并用
+
23.50, 19.93; HRMS (ESI), m/Z：理论值 C 43H 45BNO 4 ， 平板摇床摇匀。最后使用酶标仪在 490 nm 波长处检
+
[M] 650.6455, 实测值 650.3434。 测每孔的光密度。其中，在测定探针浓度与细胞存
1.3 结构表征与性能测试 活率的关系实验时，加入探针后孵育时间为 48 h，
1.3.1 母液的配制 为避免实验偶然性，分别进行了 3 组平行实验；在
将 TC-BOR 溶于 DMSO 制得 探针母液 测定作用时间与细胞存活率的关系实验时，加入探
（1.0 mmol/L）；用超纯水稀释质量分数为 30%的 针后孵育时间分别为 0、12 以及 24 h。
H 2 O 2 溶液制得 H 2 O 2 母液（1.0 mmol/L）；用氢氧化 1.3.4 细胞成像
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钠溶液和磷酸溶液调节 PBS 缓冲溶液的 pH，制得 首先将 Hela 细胞以 2×10 的密度接种在玻璃底
终浓度为 100 mmol/L，pH = 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、 的培养皿中，置于 37 ℃、含体积分数 5%的 CO 2 、
7.4、8.0、9.0、10.0 及 11.0 的 PBS 缓冲溶液；配制 相对湿度 100%的细胞培养箱中孵育 24 h。随后将
分析物 FeCl 3 、KCl、NaNO 3 、NaNO 2 、CaCl 2 、FeSO 4 、 探针母液加入细胞培养皿中再孵育 30 min，并用
Na 2 SO 4 、NaHCO 3 、Na 2 SO 3 、CuSO 4 、Cys（半胱氨 PBS 缓冲液洗 3 遍。用含有 H 2 O 2 的新鲜 DMEM 培
酸）、Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）、Trp（色氨 养液（含各种氨基酸和葡萄糖的培养液，利于细胞
酸）、D-phe（D-苯丙氨酸）、GSH（谷胱甘肽）、 停泊于一个位置生长）处理细胞（H 2 O 2 终浓度为
Ser（丝氨酸）、Val（缬氨酸）、Met（蛋氨酸）、 0.1 mmol/L，浓度选择见参考文献[25,28-30]）并孵
Thr（苏氨酸）、Gly（甘氨酸）、Ala（丙氨酸）、 育 30 min，再次用 DMEM 培养液对细胞清洗 3 次，最
1
Hcy（同型半胱氨酸）、NaClO（次氯酸钠）、 O 2 后通过共焦荧光显微镜在 60 倍物镜下观察细胞成
–
（单线态氧）、ONOO （过氧亚硝基）、t-BuOOH 像，探针用 640 nm 激发，接收 650~750 nm 处荧光。
（过氧叔丁醇）、•OH（羟基自由基）的母液待选 1.3.5 定量检测食品中 H 2 O 2 含量
择性实验中进行测试。 取猪皮、鸡爪、豆干、竹笋 4 种食品萃取液〔按
1.3.2 TC-BOR 的光谱性能测试 照国标 GB 5009.226—2016（食品中 H 2 O 2 残留量的
反应在含 10%（体积分数）DMSO 的 PBS 测定）方法萃取〕、配制 H 2 O 2 终浓度为 0.1 mmol/L
（pH = 7.4，10 mmol/L）体系中进行，TC-BOR 终 的标准浓度样品并配制已知浓度的水溶液标准浓度
浓度为 10 μmol/L。实验组加入 H 2 O 2 母液（终浓度 样品，应用荧光检测法与钛盐比色法（国标 GB
为 2 mmol/L），对照组用等量水替代。测试条件： 5009.226—2016 指定方法）进行测试。