Page 156 - 《精细化工》2022年第2期
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·360·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 39 卷

            苏木精-伊红染液（H-E，生化试剂级），北京普利莱                          并随机分为 6 组（每组 12 只，详细分组见表 1）。
            基因技术有限公司；姬姆萨染料（生化试剂级），北                            分别饲喂 10% LFD 和 60% HFD 饲料，期间，每日
            京索莱宝科技有限公司；重组人胰岛素（质量分数                             以灌胃方式给予 10 mg/(kg·BW)（BW 为体重）的
            >98%，生化试剂），丹麦 Novo Nordisk 公司；葡萄                   7,8-DHF、含有相当剂量 7,8-DHF〔10 mg/(kg·BW)〕
            糖（分析纯），美国 Sigma-Aldrich 公司；甘油三酯                    的纳米粒子、没有负载 7,8-DHF 的纳米粒子对照或
            （TG）检测试剂盒、总胆固醇（T-CHO）检测试剂                          相应的溶剂对照。7,8-DHF 的剂量依据课题组前期
            盒和游离脂肪酸（FFA）检测试剂盒，南京建成生                            的相关研究确定       [17-19] 。每周对小鼠的体重跟踪测定，
            物工程研究所；血清雌二醇（E2）酶联免疫吸附测                            每周测定 2 次摄食量。
            定（ELISA）试剂盒，上海西唐生物科技有限公司；                              MetS 一般可由 HFD 诱导而成，同时也与年龄
            血清卵泡刺激素（FSH）、抗缪勒管激素（AMH）、                          有密切关系，尤其是对于雌性小鼠。因此，本研究
            内毒素脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、                       对实验小鼠进行长达 24 周的干预。从开始干预的第
            白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒，武汉华美生                       16 周（小鼠年龄为 24 周龄）开始，对小鼠的动情
            物工程有限公司；纯化型 10%低脂饲料（LFD，编                          周期进行监测，每日上午 9~11 点进行阴道涂片检测，
            号 D12450J，10%代表脂肪热量供能占比，下同）、                       直到对照组与实验组的动情周期出现显著差异为止。
            纯化型 60%高脂饲料（HFD，编号 D12492，60%代
            表脂肪热量供能占比，下同），美国 Research Diets                                  表 1   动物分组详情
                                                                           Table 1  Animal grouping
            公司。
                 ACCU-CHEK 血糖仪，瑞士 Roche 公司；Eon                     组别            膳食模式               给药
            酶标仪，美国 BioTek 公司；Nikon Eclipse E100 双              LFD  对照     10%低脂饲料（D12450J） 5% DMSO/0.5%
                                                                                              CMC-Na
            目显微镜，日本 Nikon 公司；3K15 高速离心机，德                      HFD  对照     10%低脂饲料（D12450J） 5% DMSO/0.5%
            国 Sigma 公司；Milli-Q 超纯水仪，法国 Merck 公司。                                              CMC-Na
                                                               HFD+DHF     60%高脂饲料（D12492）  7,8-DHF
            1.2   实验动物
                 8 周龄无特定病原体 （SPF 级）C57BL/6J 雌性                 HFD+No-load   60%高脂饲料（D12492）  无 7,8-DHF 的空载
                                                                                              纳米粒子
            小鼠购自上海 Sippr BK 实验动物有限公司。所有动
                                                               HFD+DHF-load 60%高脂饲料（D12492） 7,8-DHF 纳米粒子
            物实验均经浙江中医药大学动物实验中心动物保护
            与使用 委 员会（ IACUC ） 批准（ 批 准文号 ：                          注：每组 12 只小鼠，每笼 4 只；LFD 对照—低脂对照组；
                                                               HFD  对照—高脂对照组；HFD+DHF—高脂膳食+7,8-DHF〔剂
            IACUC-20180514-03）。于浙江中医药大学实验动物
                                                               量：10 mg/(kg·BW·d)〕；HFD+No-load—高脂膳食+无 7,8-DHF
            中心 SPF 屏障系统内饲养，每天 12 h 光照和 12 h                    的空载纳米粒子对照组；HFD+DHF-load—高脂膳食+7,8-DHF
            黑暗交替循环，自由饮水和摄食。                                    纳米粒子，相当于 7,8-DHF 的剂量为 10 mg/(kg·BW·d)；7,8-DHF
            1.3    方法                                          或纳米粒子混悬于体积分数 5% DMSO/质量分数 0.5%羧甲基纤
                                                               维素钠溶液中（5% DMSO/0.5% CMC-Na）。
            1.3.1  7,8-DHF 纳米粒子制备方法
                 7,8-DHF 纳米粒子由浙江大学天然产物与人类                      1.3.3   小鼠动情周期监测
            健康中心制备，方法参考之前已报道文献                    [23-24] 。称       自干预的第 16 周起，对小鼠动情周期进行监
            取 20 mg 7,8-DHF 预溶于 100 μL DMSO 中，采用碱              测。小鼠的动情周期通常持续 4~5 d，包括动情前期、
            滴定法将其充分溶解至 10 mL 超纯水中，测得 pH                        动情期、动情后期和动情间期。通过阴道涂片的细
            为 7.6；称取 250 mg 芜菁多糖并溶解于 50 mL 超纯                  胞学分析方法确定所处的动情周期                [26] 。
            水中，在 30~50 ℃的恒温磁力搅拌器上，将上述                          1.3.4   葡萄糖和胰岛素耐受测试
            10 mL  7,8-DHF 溶液与 50 mL 芜菁多糖溶液充分混                     在饲养即将结束的最后一周（干预的第 23 周），
            匀；另将预先配制的质量浓度为 2.5 g/L ε-多聚赖氨                      进行腹腔注射葡萄糖耐受（GTT）和胰岛素耐受测
            酸溶液（20 mL）通过恒流泵（流速为 300 mL/h）                      试（ITT）。小鼠禁食一定时间后（对于 GTT，禁食
            滴入 7,8-DHF 和芜菁多糖混合溶液中，继续缓慢搅                        12~16 h；对于 ITT，禁食 4~6 h），剪鼠尾尖取血测
            拌 30 min，得到 80 mL 7,8-DHF 纳米粒子混悬液，                 定的空腹血糖值作为零时刻（0 min）血糖值。之后，
            加入 6.4 mg γ-环糊精（质量分数为 8%）作为冻干保                     通过腹腔内注射将质量浓度为 0.2 kg/L 葡萄糖溶液
            护剂于40 ℃进行冻干，制得 7,8-DHF 纳米粒子，                      （剂量为 2 g/kg 体重）或 0.075 U/mL 胰岛素溶液（剂
            用于后续动物实验。                                          量为 0.75 U/kg 体重）注射进小鼠体内，并准确记录
            1.3.2   动物实验设计                                     每只小鼠注射完毕的时间。分别在注射后的 30、60、
                 小鼠经过一周的适应性饲养以后，剪脚趾编号                          90、120 min 时间点从尾静脉取血，采用血糖仪测定
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