Page 146 - 《精细化工》2023年第11期

·2458· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

DB104 (pWB980)、B. subtilis MTV13 和 B. subtilis 50%（图 2b），说明突变体 ManBl(I91N/L211I)的热
FGYM102 在相同条件下进行发酵 4 d 后，对发酵液 稳定性较对照组有所降低，该结果与 I-mutant 2.0 预
进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 测结果一致 [39] ，I91N 和 L211I 的自由能变化（ΔG），
（SDS-PAGE）电泳，检测胞外蛋白的分泌情况， 即 DDG，分别为–8.2 和–5.4 kJ/mol，说明突变体热
结果见图 1a。由图 1a 可以发现，对照菌株 B. subtilis 稳定性降低。
DB104 (pWB980)未检测到约 39 kDa 的目的条带（泳
道 1），β-甘露聚糖酶表达菌株 MTV13 和 FGYM102
都检测到了约 39 kDa 的目的条带（泳道 2 和泳道 3），
说明 β-甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌中进行了良好表
达和分泌，且抗生素表达系统和食品级表达系统的
表达及分泌无明显差别。由于抗生素滥用会对生物
安全性造成威胁，因此构建无抗生素标记的食品级
表达系统已成为一种趋势，如对 D-阿洛酮糖 3-表位
酶（DPease）及含铁脲酶（Bp-Urease）的食品级表
达 [18,20,38] ，而关于 β-甘露聚糖酶的食品级表达尚未
见其他报道。
为便于对 β-甘露聚糖酶酶学性质进行研究，对
ManBl 及突变体 ManBl(I91N/L211I)进行了纯化，结
果如图 1b 所示。

a—不同 B. subtilis 工程菌株分泌 β-甘露聚糖酶，M 为蛋白质相
对分子质量标准，DB104 (pWB980)（泳道 1）、MTV 13（泳道 2）、
FGYM102（泳道 3）；b—纯化的 ManBl（泳道 1）和 ManBl
(I91N/L211I)（泳道 2）
图 1 SDS-PAGE 分析 β-甘露聚糖酶的分泌及纯化
Fig. 1 SDS-PAGE analysis of β-mannanase secretion and
purification

从图 1b 可见，条带单一，蛋白纯化效果好，可
用于后续酶学属性分析。
2.3 β-甘露聚糖酶及其突变体的酶学性质

按照 1.3.5 节实验方法，考察了 β-甘露聚糖酶
ManBl 及突变体 ManBl(I91N/L211I)的酶学性质，结果 a—最适温度；b—70 ℃时酶的热稳定性；c—最适 pH；d—
ManBl(I91N/L211I)酶活性受不同金属离子的影响
见图 2。可以看出，最适温度 60 ℃、最适 pH 为 6.0 图 2 β-甘露聚糖酶 ManBl 和 ManBl(I91N/L211I)的酶学
（图 2a 和 c）。ManBl 和突变体 ManBl(I91N/L211I) 性质
在不同温度下的相对酶活性相差不明显（图 2a）；二 Fig. 2 Enzymatic properties of β-mannanase ManBl and
者在 70 ℃孵育 30 min，剩余酶活性分别为 75%和 ManBl(I91N/L211I)