Page 145 - 《精细化工》2023年第11期
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第 11 期               陈   赟，等:  高酶活性 β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖                               ·2457·


            质粒构建是否正确。                                          web.expasy.org/protparam/）进行分析，该酶的信号
            1.3.4   蛋白纯化和定量                                    肽由 SignalP-6.0 分析  [30] ，蛋白保守结构域由 Interpro
                 应用色谱系统纯化 ManBl 及其突变体 ManBl                    进行分析    [31] 。以 RCSB 数据库中具有晶体结构的
            (I91N/L211I)，所有操作都在 4  ℃进行。将菌株 B.                  BCman 蛋白（2qha）为模板        [32] ，应用 Modeller 软件
            subtilis MTV13 和 FGYM102 的第 4 d 发酵液进行              进行同源建模预测 β-甘露聚糖酶三维结构                [33] ，分子动
            8000 r/min 离心 15 min，再经 0.45  μm 滤膜过滤 2            力学 模拟 采 用 GROMACS 软件 进行             [34]  ，使 用
            次，将 100 mL 过滤后的发酵液装载至 Q Sepharose                  GROMACS54a7 力场参数，将蛋白分子置于正方体盒
            XL XK 16/20  柱（柱床容积约 30 mL），并以缓冲液                  子内，填充 TIP3P 显性水模型，设置周期性边界条件、
            A（20 mmol/L Tris, pH 7.0）平衡，未结合的蛋白用                添加拮抗离子以中和负电荷。以含 8 个糖单元的甘露
            相同的缓冲液漂洗，结合的蛋白用 0~1 mol/L  NaCl                    聚糖分子为底物进行 Autodock 分子对接分析              [35] 。
            （溶于缓冲液 A）以 3 mL/min 的流速进行洗脱，洗
            脱后样品蛋白浓度应用 Lowry kit 试剂盒进行测定。                      2   结果与讨论
            1.3.5   酶的生物化学性质测定
                 应用 DNS 法测定 β-甘露聚糖酶活性             [29] ，底物     2.1   manBl 基因定向进化及筛选
                                                                   尽管 β-甘露聚糖酶可来源于动物、植物和微生
            为溶于 pH 6.0 的磷酸缓冲液的 KGM（质量分数为
                                                               物，然而，野生型的酶因酶活性低、稳定性差等问
            0.5%）。将 30 µL 适当稀释的酶或发酵液加入 270 µL
                                                               题阻碍 了其在工业 领域中的应 用               [2,36]  。由 于 B.
            底物中，混匀后在 60  ℃孵育 10 min，再加入 600 µL
                                                               licheniformis KD-1 β-甘露聚糖酶（ManBl）具有较高
            DNS，煮沸 10 min，立即冰水冷却，测量 540 nm 吸
                                                               的热稳定性     [24] ，为了进一步提高其酶活性，对 ManBl
            光度（OD 540）。β-甘露聚糖酶活性的定义，1 U 为单位
                                                       [1]
            时间内给定实验条件下释放 1 μmol D-甘露糖的量 。                      成熟肽基因进行了随机突变。经 SignalP-6.0 预测             [30] ，
                                                               信号肽由 N 端的 24 个氨基酸组成。因此，成熟肽编
                 在 pH 6.0 下，测定不同温度（30~90  ℃）下酶
                                                               码框为 1008 bp。
            活性，以确定酶的最适反应温度。将酶在 70  ℃孵
            育 30 min 后，并在标准条件下测定剩余酶活性，以确                           应用易错 PCR 对编码成熟肽的 manBl 基因进行
            定酶的热稳定性。在最适温度下，测定不同 pH（3.0~                        了突变，将 manBl 基因及其突变产物克隆至枯草芽
            12.0）条件下的酶活性，以确定酶的最适 pH。为了                         孢杆菌表达载体 pWB980 的 P43 启动子和 sacB 信号
            研究不同金属离子对酶活性的影响，10 mmol/L 不                        肽基因下游，转化入 B. subtilis DB104，通过刚果红
                                                        2+
                                              2+
                                                   +
                                   2+
                                        2+
                              +
            同金属离子溶液（K 、Mn 、Zn 、Ca 、Na 、Cu 、                    平板筛选，获得了大约 1000 个克隆，其中 170 个克
               2+
            Mg ）与等体积适当稀释的酶液混合，37  ℃孵育                          隆较对照有更大的透明圈。挑取具有较大透明圈的
            1 h，剩余酶活性在 pH 6.0、60  ℃条件下进行测定，                    克隆至 24 孔板培养进行第二次筛选，初测酶活性后，
            相同条件下未加金属离子处理的作为对照。有关酶                             再将具有较高酶活性的菌株进行 40 h 发酵培养，获
            活性测定实验重复 3 次。                                      得了酶活性提高 5%、8%、24%的 3 株克隆，分别命
            1.3.6  MOS 的测定                                     名为 YM40、YM70、YM102。测序结果表明，3 个
                 β-甘露聚糖酶水解 KGM 的产物通过高效液相                       β-甘露聚糖酶突变体分别为 ManBl(Y247D/T272M)、
            色谱法（HPLC）进行测定。在质量分数 0.5%的 KGM                      ManBl(S96G)和 ManBl(I91N/L211I)。
            底物中加入 0.5~50 U/mL 的 β-甘露聚糖酶 ManBl 或                2.2   manBl(I91N/L211I)基因食品级表达及蛋白纯化
            突变体 ManBl(I91N/L211I)，在 60  ℃反应 30 min；或               鉴于 β-甘露聚糖酶在食品及动物养殖中的广泛
            加入 0.5 U/mL ManBl 或突变体 ManBl(I91N/L211I)，          应用，将 manBl(I91N/L211I)基因在 B. subtilis 中进行
            在 60  ℃  孵育 1~6 h，按 1.3.5 节方法终止反应，水                了食品级表达，该系统的构建是基于 D-丙氨酸消旋
            解产物 12000 r/min 离心 10 min，再经 0.22 µm 滤膜            酶基 因 dal 的 互 补性实 现的          [37]  。首 先， 应 用
            过滤进行 HPLC 分析，色谱条件为 Welch Xtimate            TM     CRISPR/Cpf1 技术敲除 B. subtilis 的 D-丙氨酸消旋酶
            Sugar-Ca 柱（7.8 mm×300 mm×8 µm），流动相为超               的食品级表达载体 pWB-DMBM3；将基因 dal 构建
            纯水，流速为 0.3 mL/min。甘露糖（DP1）、甘露二                     B. subtilis 食品级底盘细胞 B. subtilis DB104 Δdal，命
            糖（DP2）、甘露三糖（DP3）、甘露四糖（DP4）、甘                       名为 B. subtilis DBFG-1；然后，应用 dal 基因替换
            露五糖（DP5）和甘露六糖（DP6）用作标准品。                           pWB-MBM3 载体上的卡那霉素抗性基因和博来霉素
            1.3.7   β-甘露聚糖酶结构及分子动力学模拟分析                        抗性基因，构建pWB-DMBM3 转化入B. subtilis DBFG-1
                 β-甘露聚糖酶蛋白的基本性质，如相对分子质                         感受态细胞，获得 manBl(I91N/L211I)基因食品级表达
            量和等电点（pI），通过在线软件 Protparam（https://                菌株 B. subtilis FGYM102。工程菌株 B. subtilis
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