Page 149 - 《精细化工》2023年第11期
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第 11 期               陈   赟，等:  高酶活性 β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖                               ·2461·


                                                               3   结论


                                                                  （1 ）获得的 β- 甘露聚糖酶突变 体 ManBl
                                                               (I91N/L211I)，首次在枯草芽孢杆菌中实现了食品级
                                                               表达，比酶活性为 15554.7 U/mg，为其在食品加工、
                                                               饲料等领域的安全应用奠定了基础。
                                                                  （2）尽管 ManBl(I91N/L211I)突变体使酶的热稳
                                                               定性有一定程度降低，但 2 个氨基酸位点位于酶的
                                                               催化中心之外，该突变使突变体蛋白柔性结构增加，
                                                               与底物能够更好结合，是使酶活性有很大提高的主
                                                               要原因。
                                                                  （3）应用 ManBl(I91N/L211I)水解 KGM 制备
                                                               MOS 时，可在 60  ℃、pH 6、0.5 U/mL 的酶、酶解
                                                               1 h 的条件下进行，制备得到的 MOS 质量分数达
                                                               86%。

                                                               参考文献：

                                                               [1]   SONGSIRIRITTHIGUL  C,  BURANABANYAT B, HALTRICH D,
                                                                   et al. Efficient recombinant expression and secretion of a thermostable

                                                                   GH26 mannan endo-1,4-beta-mannosidase from Bacillus licheniformis
            注：KGM 被不同用量的 β-甘露聚糖酶在 60  ℃水解 30 min 产生                in Escherichia coli[J]. Microbial Cell Factories, 2010, 9: 20.
            的 MOS，a—ManBl、b—突变体 ManBl(I91N/L211I)；应用 0.5       [2]   ZHANG W, LIU Z M, ZHOU S J, et al. Cloning and expression of a
            U/mL  β-甘露聚糖酶在 60  ℃下不同时间内水解 KGM 产生的                   β-mannanase gene from Bacillus sp. MK-2 and its directed evolution
            MOS，c—ManBl、d—ManBl (I91N/L211I)                       by random mutagenesis[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2019,
                                                                   124: 70-78.
                  图 8   β-甘露聚糖酶水解 KGM 形成的 MOS
             Fig. 8    MOS formed by hydrolysis of KGM by β-mannanase   [3]   WU G, BRYANT  M M, VOITLE R  A,  et al. Effects of  beta-
                                                                   mannanase in corn-soy diets on commercial leghorns in second-cycle

                 由于 β-甘露聚糖酶用量 0.5 与 50 U/mL 时，水                    hens[J]. Poultry Science, 2005, 84(6): 894-897.
                                                               [4]   ANGURAL S, BALA I, KUMAR A, et al. Bleach enhancement of
            解 KGM 所形成的 MOS 总量变化不大，为降低制备                            mixed wood pulp  by  mixture of thermo-alkali-stable xylanase and
            MOS 成本，节约酶用量，进一步探究了 β-甘露聚糖                             mannanase derived through co-culturing of alkalophilic Bacillus sp.
                                                                   NG-27 and Bacillus nealsonii PN-11[J]. Heliyon, 2021, 7(1): e05673.
            添加量为 0.5 U/mL 时，延长酶反应时间（1~6 h）                     [5]   SINGH S, SINGH  G, KHATRI  M,  et al. Thermo and alkali stable
            水解 KGM 的情况见图 8c 和图 8d。由图 8c 可知，                        β-mannanase: Characterization and application for removal of food
                                                                   (mannans based) stain[J]. International Journal of Biological
            当 ManBl 用量为 0.5 U/mL 时，当水解时间由 1 h
                                                                   Macromolecules, 2019, 134: 536-546.
            延长至 6 h 时，形成的 MOS 质量分数由 84.5%增至                    [6]   SACHSLEHNER  A, FOIDL  G, FOIDL N,  et al. Hydrolysis of
            88.9%。当突变体 ManBl(I91N/L211I)添加量 0.5                    isolated coffee  mannan and coffee extract by  mannanases of
                                                                   Sclerotium rolfsii[J]. Journal of Biotechnology, 2000, 80(2): 127-134.
            U/mL，在 1~6 h 内，水解 KGM 形成的 MOS 占总水                  [7]   LIU H X, GONG J S, LI H, et al. Biochemical characterization and
            解产物的 86%（图 8d），与应用添加 50 U/mL 的酶                        cloning of an endo-1,4-β-mannanase from  Bacillus subtilis YH12
                                                                   with unusually broad substrate profile[J]. Process Biochemistry,
            水解 30 min 所形成的 MOS 质量分数（图 8b）无明
                                                                   2015, 50(5): 712-721.
            显区别，所形成的 MOS 质量分数并没有随孵育时间                          [8]   KALIDAS N R, SAMINATHAN M,  ISMAIL I S, et al. Structural
            延长而增加。从经济角度出发，以 KGM 为原材料                               characterization and evaluation of prebiotic activity of oil palm
                                                                   kernel cake mannanoligosaccharides[J]. Food Chemistry, 2017, 234:
            制备 MOS 时，建 议 应 用 0.5 U/mL 突变体                          348-355.
            ManBl(I91N/L211I) 60  ℃水解 1 h。                     [9]   DEVARAJ R D, REDDY C K, XU B J. Health-promoting effects of
                 本 研究的 β- 甘露 聚糖酶 ManBl 或 突变体                       konjac glucomannan and its  practical applications:  A critical
                                                                   review[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019,
            ManBl(I91N/L211I)对 KGM 水解形成的 MOS，与前                    126: 273-281.
            人应用 β-甘露聚糖酶 ManB 对刺槐豆胶（LBG）的研                      [10]  KATROLIA P, ZHOU P, ZHANG P, et al. High level expression of a
                                                                   novel  β-mannanase from  Chaetomium sp. exhibiting efficient
                                                        [1]
            究结果类似，ManB能够水解聚合度>6的甘露聚糖 ，                             mannan hydrolysis[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(1): 480-490.
            形成甘露四糖、甘露三糖和甘露二糖；本研究报道的                            [11]  DAWOOD  A, MA K. Applications of microbial  β-mannanases[J].
            β-甘露聚糖酶性质与 β-甘露聚糖酶 MEIR 水解 KGM                         Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8: 598630.
                                                               [12]  LIU Z M, NING C, YUAN M X, et al. High-efficiency expression of
            性质不同，MEIR 水解 KGM 所形成的 MOS，79.07%                       a superior  β-mannanase  engineered by cooperative substitution
            为 DP7-12 的寡甘露糖      [12] 。                             method in  Pichia pastoris and its application in preparation of
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