Page 152 - 《精细化工》2023年第11期
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·2464·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

            法和生物酶转化法。提取法主要是从植物细胞以及                             1.2   游离酶液及纳米 Fe 3 O 4 的制备
            动物细胞中提取分离。植物细胞中 PS 含量低，提取、                         1.2.1  scPLD 游离酶液的制备
                                                                                        [7]
            分离制备步骤复杂，成本高；牛脑细胞中 PS 含量较                              参考本实验室前期工作 ，将重组菌 pET28a+
            高，但考虑到疯牛病的隐患，此提取方法也很少使                             scPLD/BL21(DE3)按照体积分数 1%的接种量接种
            用。酶转化法是以卵磷脂和 L-丝氨酸为底物，经磷                           至发酵培养基（质量分数 0.7%山梨醇、质量分数
            脂酶 D（PLD）催化转磷脂酰作用生成 PS。相较而                         0.3%淀粉、质量分数 1.0%鱼蛋白胨、质量分数 4.0%
                                                               安琪酵母、17 mmol/L KH 2PO 4 和 72 mmol/L K 2HPO 4）
            言，生物酶法由于工艺绿色、副产物少等突出优势，
                                                               中培养 32 h 后，发酵液于 4  ℃、8000 r/min 离心 10 min
            成为目前 PS 合成中最安全高效的方法。
                                                               收集菌体。取菌体（相当于 5 mL 发酵液离心所得的
                 催化合成 PS 的 PLD 形式主要有游离酶和固定
                                                               菌体）加入 15 mL 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）
            化酶两种。游离酶稳定性差、不能重复使用，催化
                                                               进行超声破碎（超声条件：300 W 功率下，工作 3 s，
            反应后 PLD 不易与产品分离，增加了生物酶法工艺
                                                               间隔 5 s 为一个循环，超声 10 min），然后在 4  ℃、
            的酶制剂成本和分离成本。因此，制备廉价、稳定、
                                                               8000 r/min 离心 10 min 后，收集上清液置于干净的
            易回收和高活性的 PLD 固定化酶对 PS 的合成有重                        离心管中，即为 scPLD 游离酶液。
                                 [4]
            要意义。TAKAMI 等 运用阳离子交换树脂固定
                                                               1.2.2   纳米级 Fe 3 O 4 载体的制备
            PLD，虽然固定化的 PLD 稳定性较好，但是固定化                             参考 RANJBAKHSH 等 的方法并作适当调整。
                                                                                       [8]
                                              [5]
            酶活回收率、酶活均较低。OGINO 等 利用生物质                          取 2.5 g FeCl 2 •4H 2 O 和 6.8 g FeCl 3 •6H 2 O 加入 200 mL
            载体颗粒直接固定链霉菌（Streptomyces lividans）                 去离子水，加热到 60  ℃后加入体积分数为 25%的
            细胞，实现连续产生 PLD，产率只能达到 1.5 U/mL，                     氨水，剧烈搅拌 1 h。通过磁铁进行吸附沉降，将上
                            [6]
            产率较低。LI 等 购买商品化的 PLD，运用 SiO 2                      清液倒去，沉淀用去离子水浸没反复洗涤 3 遍，然
            作为载体，固定化后的 PLD 具有较高的酶活，但是                          后加入 200 mL 去离子水，放置于超声波清洗机中，
            整个过程步骤较复杂、固定化成本高，且载体粒径                             设置功率为 100 W，超声 1 h。用磁铁进行沉降，将
            较小，不利于固定化酶的回收。                                     固体用称量勺取出放置于干净烧杯中置于 60  ℃烘
                 本课题组前期在大肠杆菌中克隆、表达了                            箱内干燥 3 h，取出反复研磨后，收集纳米级 Fe 3 O 4
            Streptomyces chromofuscus 来源的 PLD（scPLD），          载体，常温放置在干燥器中，备用。
            并通过培养基、培养条件的系统优化实现了 scPLD                          1.3  MCLEA 的制备
                             [7]
            的高水平发酵制备 。本研究在前期研究的基础上，                                取一定量的磁性 Fe 3 O 4 载体，加入 scPLD 游离
            采用吸附-聚集-交联的方法尝试制备易回收的磁性                            酶液（1.2.1 节）中，在 4  ℃、200 r/min 下振荡 2 h，
            磷脂酶 D 交联酶聚集体（MCLEA），并对其最适温                         缓慢加入于 4  ℃预冷的沉淀剂异丙醇中，冰浴
            度及热稳定性、最适 pH 及 pH 稳定性、最适底物浓                        20 min。直接向该沉淀体系中加入体积分数 0.01%的
                        2+
            度、最适 Ca 浓度、有机溶剂耐受性和连续酶促反                           戊二醛，将整个体系放置在 4  ℃的环境下，200 r/min
            应的稳定性等性质进行研究，以期制备易回收、性                             振荡 80 min。然后，通过磁铁使得 MCLEA 沉降，
            质稳定和高活性的 scPLD 固定化酶。                               移去上清液，用等体积 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液
                                                               （pH 8.0）反复洗涤 3 次。最后用磁铁收集 MCLEA。
            1   实验部分                                           1.4  MCLEA 的制备条件优化
                                                               1.4.1   酶活和蛋白含量的测定
            1.1   材料、试剂与仪器
                                                                                                   [9]
                                                                   scPLD 酶活测定：参照酶联显色法 并作了部
                 工程菌株 pET28a+scPLD/BL21(DE3)，由本实               分修改。取底物溶液 100 µL（含有 1 g/L PC、10
                             [7]
            验室重组构建获得 ；磷脂酰胆碱（PC）（分析纯），
                                                               mmol/L CaCl 2 和体积分数为 0.1%的曲拉通）与 50
            上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胆碱氧化酶（分                            µL 的 scPLD 酶液混合，然后在 37  ℃水浴锅中反应
            析纯），美国 Sigma-Aldrich  公司；辣根过氧化物酶（分                 5 min。待反应结束后，加入 20 µL 的反应终止液
            析纯），生工生物工程（上海）股份有限公司；戊二醛、                          〔0.37224 g  EDTA-2Na  溶于 10 mL 的 1.0 mol/L
            FeCl 3•6H 2O（分析纯），国药集团化学试剂上海有限                     Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）〕，沸水浴 5 min；待冷却
            公司。其他试剂、药品均为市售分析纯。                                 至室温后，分别加入 10 µL 的显色液〔75 mg 苯酚、
                 VERTEX 80V 型红外光谱仪，德国 Bruker 公                 62.5 mg 4-氨基安替比啉溶于 50 mL 的 0.1  mol/L
            司；JSM-7600F 型扫描电子显微镜，日本电子株式                        Tris-HCl  缓冲液（pH 8.0）〕和 10 µL 的显色酶液〔12.5
            会社。                                                U 的胆碱氧化酶和 10 U 的辣根过氧化物酶溶于 1 mL
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