Page 153 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 石婷婷，等: 磁性磷脂酶 D 交联酶聚集体的制备及其酶学性质 ·2465·

的 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中，分装后 0.01%、0.05%、0.1%、0.2%，在 4 ℃、200 r/min
放于–80 ℃保存〕；混匀后，在 37 ℃下显色 2 h。 振荡交联 1 h。分别收集沉淀的 MCLEA 和上清液，
显色结束后，在 505 nm 处测定其吸光度。同时，以 将沉淀用 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）浸没
不同浓度的氯化胆碱溶液为标准品建立标准曲线。 反复洗涤 3 次，测定上清液和洗涤液中的蛋白含量，
酶活的定义为每分钟水解释放 1 µmol 氯化胆碱所需 同时测定固定化酶的酶活，计算固定化酶活回收率
要的酶量为 1 个酶活单位。氯化胆碱溶液的标准曲 （具体方法见 1.4.1 节）。
线 方程为： y=3.9011x+0.0201 (0.05<x<0.3) ， 1.4.6 交联时间的优化
2
R =0.9997，在 0.05~0.3 mmol/L 浓度范围内的线性 根据 1.4.5 节得到交联剂戊二醛最优的体积分
关系较好，说明该方程可以用于酶活的定量分析。 数，在沉淀体系（见 1.3 节）中添加体积分数为 0.01%
蛋白含量的测定：以牛血清白蛋白为标准，采 的戊二醛后，在 4 ℃，200 r/min 下分别振荡交联
用 Bradford 法测定蛋白含量 [10] 。 20~100 min。测定不同交联时间（20、40、60、80、
根据 MCLEA 酶活及蛋白含量相关结果，按照 100 min）对 MCLEA 酶活回收率和蛋白回收率的影
公式（1）、（2）计算酶活回收率和蛋白回收率： 响，分别收集沉淀的 MCLEA 和上清液。将沉淀用
酶活回收率/%=MCLEA 总酶活/投入总酶活×100 （1） 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）浸没反复冲洗
蛋白回收率/%=（投入总蛋白浓度–固定化后上清中蛋 3 次，测定上清液和洗涤液中的蛋白含量，同时测
白浓度）/投入总蛋白浓度×100 （2） 定固定化酶的酶活，计算固定化酶酶活回收率。
1.4.2 沉淀剂体积分数的筛选 1.5 游离酶及 MCLEA 性质研究
研究不同的沉淀剂（甲醇、乙醇、丙醇、异丙 1.5.1 最适温度和热稳定性
醇、丙酮、叔丁醇）对 scPLD 的沉淀效果以及残余酶 最适温度：在 27、32、37、42、47、52、57、
活的影响。在 4 ℃预冷的沉淀剂中缓慢滴入 100 µL 62、67 ℃下测定游离酶和 MCLEA 的酶活。
scPLD 游离酶液，边滴边轻微振荡，使沉淀剂最终 热稳定性：在不同温度下（25、30、37、45、
体积分数达到 90%，最终溶液总体积为 1 mL。随后 55、65 ℃）将游离酶和 MCLEA 孵育 0.5、1、2、3、
冰浴 20 min，离心收集上清液于干净离心管中，沉 4、5、6 h。测定每个时间点的酶活（具体方法见 1.4.1
淀置于干净烧杯中，取上清液测定未沉淀蛋白含量 节）并将每组实验中最高的酶活设定为 100%，计算
（具体方法见 1.4.1 节），将沉淀复溶于 0.1 mol/L 不同条件下的相对酶活（%）。
Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中测定残余酶活（具体方 1.5.2 最适 pH 和 pH 稳定性
法见 1.4.1 节）。 最适 pH：在不同 pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、
1.4.3 沉淀剂体积分数的优化 9.5）Tris-HCl 缓冲液中测定游离酶和 MCLEA 酶活，
选择最优沉淀剂异丙醇，研究其不同浓度对 比较不同 pH 下的酶活。
scPLD 的沉淀效果。取不同体积的 scPLD 游离酶液， pH 稳定性：在不同 pH（5.0、7.0、8.5、9.0、
缓慢滴入于 4 ℃预冷的异丙醇中，使异丙醇体积分 10.0）Tris-HCl 缓冲液中将游离酶和 MCLEA 分别孵
数分别为 55%~90%（体积分数间隔为 5%），最终溶 育 0.5、1、2、3、4、5、6 h。测定每个时间点的酶
液总体积为 1 mL。其余操作同 1.4.2 节。 活并将每组实验中最高的酶活设定为 100%，计算不
1.4.4 Fe 3 O 4 投入量的优化 同条件下的相对酶活（%）。
分别称取20~60 mg 纳米级Fe 3 O 4 载体加入到不同 1.5.3 最适底物浓度和米氏常数（K m ）
体积的 scPLD 游离酶液中，25 ℃、200 r/min 气浴振 底物浓度会对酶促反应速率产生影响，随着底
荡 1 h。然后加入体积分数为 80%的异丙醇溶液，冰 物浓度升高酶促反应速率也会越快，为了研究游离
浴 20 min。随后将固定化酶用磁铁沉降，分别收集 酶和 MCLEA 在水相的最适底物浓度，配制含有 0.2、
沉淀和上清液（上清液直接倒在干净离心管中保存， 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 g/L PC 的底物溶液，
沉淀用称量勺取出置于干净烧杯中），将沉淀（固定 在 37 ℃，0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中测
化酶）用 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）浸没 定不同底物浓度下游离酶和 MCLEA 的酶活，将每
反复洗涤 3 次，测定上清液和洗涤液中的蛋白含量 组最高酶活定为 100%，计算不同底物浓度下的相对
以及固定化酶的酶活（具体方法见 1.4.1 节）。 酶活（%），比较得出最适底物浓度。同时通过米氏
1.4.5 交联剂浓度的优化 方程 （ V  V max c ， 其中 ， V 为酶 反应 速度，
选用固定化效率高且可以很大程度保留酶活性 K c
m
的戊二醛作为交联剂。在沉淀体系（见 1.3 节）中 µmol/(min·mg)；V max 为酶被底物饱和时的反应速度，
添加戊二醛，使戊二醛最终体积分数分别为 0.005%、 µmol/(min·mg)；c 为底物浓度，mol/L；K m 为米氏