Page 154 - 《精细化工》2023年第11期

·2466· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

常数，mol/L）来比较游离酶和 MCLEA 在水相中 80%时，蛋白完全沉淀。残余酶活也随着异丙醇体
酶促最大反应速率达到一半时所需的底物浓度及 积分数增加而增加，但当体积分数高于 80%，酶活
K m 值。 呈现下降的趋势，可能是沉淀剂体积分数过高时会
2+
1.5.4 Ca 的影响 对 scPLD 产生毒害作用。BRADFORD 课题组 [10] 在
2+
PLD 的催化活性需要 Ca 作为辅因子 [11] 。测定 使用乙醇对商品化的 PLD 进行沉淀时，也得到相同
2+
在不同 Ca 浓度（0、2.5、7.5、10、20 和 30 mmol/L） 结果。因此，将异丙醇的体积分数确定为 80%。
下游离酶和 MCLEA 的酶活，将每组最高酶活设为
100%，计算不同条件下的相对酶活（%）。
1.5.5 有机溶剂的影响
选取 logP（油水分配系数）为–1.3~3.5 的 14 种
有机溶剂（二甲基亚砜、甲醇、乙腈、乙醇、四氢
呋喃、叔丁醇、乙酸乙酯、乙醚、正戊醇、氯仿、甲
苯、正辛醇、石油醚和正己烷），将游离酶和 MCLEA
分别在体积分数为 25%、50%和 75%的有机溶剂中混
合，25 ℃、200 r/min 振荡孵育 2 h。将未加有机溶
剂组确定为对照组，酶活设为 100%，计算不同条件
下的相对酶活（%）。
1.5.6 重复使用性及半衰期
在 1.5 mL 离心管中加入 200 µL 反应底物（含
有 1 g/L PC、10 mmol/L CaCl 2 和体积分数为 0.1%的
曲拉通），加入 50 mg MCLEA，37 ℃振荡反应 10 min，
重复上述步骤多次（13 次）反应。每一次反应结束
后，用磁铁对 MCLEA 进行回收。对每一次收集的
MCLEA 测定酶活，设定第一批次酶活为 100%，计
算不同批次下的相对酶活(%)。MCLEA 酶活半衰期

按照 DINÇER 等 [12] 报道的方法计算。 图 1 不同沉淀剂（A）及不同体积分数异丙醇（B）对
scPLD 沉淀效果的影响
2 结果与讨论 Fig. 1 Effect of different precipitants (A) and different
volume fraction of isopropanol (B) on precipitation
2.1 MCLEA 的制备 effect of scPLD

2.1.1 沉淀剂的筛选 2.1.3 Fe 3 O 4 投入量对固定化 scPLD 酶活回收率和
亲水的有机溶剂可以降低水中蛋白的溶解性， 蛋白回收率的影响
从而使得蛋白析出，但在使用的同时会损失酶活 [13] ， 以体积分数为 80%的异丙醇为最佳沉淀剂，继
因此选择适合的沉淀剂对后续保持较好的酶活回收
续优化 Fe 3 O 4 的投入量对固定化 scPLD 酶活回收率
率有重要意义。不同沉淀剂对 scPLD 沉淀效果影响
和蛋白回收率的影响，结果如图 2 所示。从图 2 可
见图 1A。如图 1A 所示，叔丁醇为沉淀时蛋白回收
以看出，随 Fe 3 O 4 投入量的增加，蛋白回收率先增
率最低，为 68.25%±2.15%；甲醇、乙醇、异丙醇和
加后降低，磁性固定化 scPLD 的酶活回收率也呈现
丙酮为沉淀时的蛋白回收率在同一水平，都在 100%
先增加后降低的趋势，在 m(Fe 3 O 4 )∶m(scPLD)=5∶
附近。从酶活回收率来看，乙醇作为沉淀剂时对酶
1 时，酶活回收率最高，此时，固定化酶活为
活影响最大，残余酶活只有 67.00%±3.22%，而异丙
(342.00±6.0) U/g。Fe 3 O 4 投入量较少时，scPLD 没有
醇 为沉淀时 对酶活影 响最低， 残余酶活 为
足够的载体可以结合，无法形成具有磁性的固定化
88.00%±1.99%。综合考虑，选择异丙醇作为最佳沉
淀剂进行下一步研究。 酶，导致在被 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）反
2.1.2 沉淀剂体积分数对 scPLD 沉淀效果的影响 复冲洗时，未结合 Fe 3 O 4 颗粒的酶蛋白会被复溶。
以 scPLD 的沉淀效果和残余酶活为指标，考察 此时增加 Fe 3 O 4 的投入量，蛋白回收率和酶活回收
异丙醇体积分数对 scPLD 沉淀效果的影响，结果见 率都会增加。而当 Fe 3 O 4 投入量过多时，酶蛋白可
图 1B。如图 1B 所示，随着异丙醇体积分数的增加， 以被充分固定，但单位质量载体固定的酶蛋白较少。
蛋白回收率也随之增加，当异丙醇体积分数达到 同时载体过多还会阻碍酶与底物之间的有效接触，