Page 157 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 石婷婷，等: 磁性磷脂酶 D 交联酶聚集体的制备及其酶学性质 ·2469·

C 所示〔c 为底物浓度，moL/L；V 为反应初速度，
µmol/(min·mg) 〕。根据拟合方程计算游离酶和
MCLEA 的 K m 值与最大反应速率 V max 分别为：
0.30396 mol/L、9.9009 µmol/(min·mg)和 0.36504 mol/L、
1.8932 µmol/(min·mg)。从上述数据可得出和游离酶
相比，MCLEA 的 V max 降低，K m 升高，推测 scPLD
被固定化后空间结构发生变化，与底物的亲和性
变弱。

图 6 pH 对游离酶和 MCLEA 的影响：最适 pH（A）；游
离酶的 pH 稳定性（B）；MCLEA 的 pH 稳定性（C）
Fig. 6 Effect of pH on free scPLD and MCLEA: Optimum
pH (A); pH stability of free scPLD (B); pH stability
of MCLEA (C)

如图 6A 所示，游离酶和 MCLEA 的酶活随着
pH 的升高而升高，在 pH 为 8.5 时达到最大值。当
pH 继续增大时，不论是游离酶还是 MCLEA 的酶活
都受到不同程度的损失。
游离酶和 MCLEA 在不同 pH 下的稳定性如图
6B、C 所示。在不同 pH 下，MCLEA 稳定性均有所
提高，这一结果和 XIE 等 [18] 以 Fe 3 O 4 为载体得到的
固定化脂肪酶类似。在 pH 为酸性时，游离酶和
MCLEA 酶活皆损失较多，但 MCLEA 的酶活仍可
以保留在 20%以上。在 pH 为中性和弱碱性时，二
者酶活损失都较少，其中，MCLEA 的残余酶活更
高，特别在最适 pH 8.5 的缓冲液中，酶活可达到
90%。当 pH 为强碱性时（pH 10），与游离酶相比，
MCLEA 的 pH 稳定性得到较大提升，在孵育 6 h 后
残余酶活依然达到 50%以上，此时游离酶酶活只有
20%左右。
2.2.4 最适底物浓度和 K m 值
酶的固定化通常会导致酶的活性中心不易暴
露，降低其与底物的接触 [19] 。为此，按照 1.5.3 节方
法进一步考察了底物浓度对游离酶活性和 MCLEA

活力的影响，结果见图 7A。如图 7A 所示，MCLEA
需要更高的 PC 浓度才能达到与游离酶相同的相对 图 7 游离酶和 MCLEA 的动力学表征：底物质量浓度影
响（A）；游离酶的双倒数作图（B）；MCLEA 的双
酶活。这可能是固定化后酶与底物之间的传质阻力
倒数图（C）
增加所致。
Fig. 7 Kinetic characterization of free scPLD and MCLEA:
配制不同浓度（0.025、0.0625、0.075、0.250、 Effect of substrate concentration (A); Lineweaver-
0.375、0.500 mol/L）的底物溶液，测定游离酶与 Burk plot of free scPLD (B); Lineweaver-Burk plot
of MCLEA (C)
MCLEA 的酶活，以及不同底物浓度下游离酶与
MCLEA 的反应初速度（反应底物消耗 5%以内时的 2.2.5 Ca 对游离酶和 MCLEA 活力的影响
2+
2+
反应速率）。因用米氏曲线作图所得 V max 为近似值， Ca 能够与 PLD 的活性中心结合，改变 PLD 的
所得的 K m 为近似值不够准确，所以为了更精确的获 空间结构，增强酶与底物之间的结合，促进形成具
2+
得 K m 值，以底物浓度的倒数作横坐标，反应初速度 有催化活性的中间酶-底物复合物 [20] 。Ca 对游离酶
的倒数作为纵坐标制作 1/V-1/c 双倒数图，如图 7B、 和 MCLEA 活力的影响见图 8A。