Page 162 - 《精细化工》2023年第11期
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·2474·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

            美国 Bio-Rad 公司；BT25S 型高精度天平，赛多利                     组、PSPJ 高剂量（200 mg/kg）组，每组 5 只。根据
            斯科学仪器（北京）有限公司；5811 型高速冷冻离                          《中国药典》      [18] 中竹节参成人生药剂量（6~9 g）与
            心机，德国 Eppendorf 公司。                                “实验动物与人的体表面积换算关系”进行计算，
            1.2   方法                                           最终按照 1∶2∶4 给药量分为 PSPJ 低剂量组 50
            1.2.1  PSPJ 制备及质量分数测定                              mg/kg、中剂量组 100 mg/kg、高剂量组 200 mg/kg。
                 将竹节参置于 37  ℃烘箱中干燥 6 h，然后用中                    空白对照组腹腔注射生理盐水，其余 5 组大鼠在第
            药粉碎机进行粉碎，取 20 g 粉碎后竹节参室温下用                         1、4、7 d 注射质量分数为 12%的 CCl 4 生理盐水溶
            400 mL 体积分数 95%乙醇浸泡 48 h，其中固液比                     液，注射量为 5 mL/kg。除空白对照组和模型组大
            （g∶mL）为 1∶20；接着，将其加热回流 2 h，过                       鼠灌胃生活饮用水外，其余 4 组大鼠灌胃相应浓度
            滤，取滤渣；然后，重复以上回流步骤，分别在 400                          的药物，灌胃体积为 5 mL/kg，每天 2 次。第 7 d 给
            mL 体积分数 80%乙醇及 400 mL 双蒸水下回流，收                     药结束后，晚上禁食不禁水>12 h，次日麻醉收集大
            集滤液，将滤液或经旋转蒸发仪浓缩（50  ℃）至体                          鼠肝脏组织。
            积为滤液体积的 50%（或 20%）后，用氯仿-异戊醇                        1.2.3   样本的采集及处理
            （体积比 24∶1）溶液脱蛋白〔V(滤液或浓缩液)∶                             称大鼠的体质量并记录，按照 6 mL/kg 的剂量
            V(氯仿-异戊醇)=5∶1〕充分混合、高速冷冻离心机                         腹腔注射质量浓度 200 g/L 乌拉坦水溶液对大鼠进
            离心（4  ℃，12000 r/min，10 min）；脱蛋白离心结                 行麻醉后收集血液，离心（4  ℃，4000 r/min，15
            束后，小心吸取上清液，将其缓慢加入到快速搅拌                             min），分离血清进行检测。取出肝脏组织，用滤纸
            下的 4 倍体积的体积分数 80%乙醇中进行醇沉；然                         吸干后称其质量，作为肝脏质量。
            后，置于 4  ℃冰柜中放置 12 h；过滤、收集沉淀，                       1.2.4   大鼠行为学变化
            将沉淀在 37  ℃下干燥 60 min，即得 1.462 g PSPJ，                  观察各组大鼠的行为学变化以及一般情况，如
            提取率为 7.31%（提取率/%=提取物质量/生药用量                        饮食、大小便、毛发、运动量、精神状态等。
            ×100）。运用苯酚-硫酸法测定 PSPJ 质量分数                [18] ：   1.2.5   大鼠体质量及肝脏指数计算
            配制质量浓度为 0.0758 g/L 的 PSPJ 待测液，经葡萄                      每天对大鼠进行称重并记录其体质量变化，按
                                               2
            糖标准线性回归方程 y=3.39x+0.004（R =0.9976）计                式（1）计算肝脏指数：
            算得 PSPJ 待测液中糖质量浓度为 0.0696 g/L，即得                                  I/%=m 1 /m 0 ×100         （1）
            PSPJ 的中性多糖的质量分数为 91.8%（质量分数/%=                     式中：I 为肝脏指数，%；m 1 为肝脏质量，g；m 0 为
            测定的待测液质量浓度/配制的待测液质量浓度×                             大鼠体质量，g。
            100）。                                              1.2.6   苏木素-伊红（H&E）染色
            1.2.2  ALI 大鼠分组、造模与给药                                  取大鼠肝组织用多聚甲醛固定 24 h，大鼠肝组
                 目前，常用的 ALI 动物模型有 CCl 4 、对乙酰氨                  织的质量分数为 4%，经脱水、透明、浸蜡、包埋后
            基酚（APAP）、α-萘异硫氰酸酯（ANIT）、D-氨基                       用石蜡切片机制成厚度 5 μm 左右的切片，然后 H&E
            半乳糖/脂多糖（D-GalN/LPS）和 3,5-二乙氧基羰基-                   染色，最后用中性树胶封片，在正置光学显微镜下
            1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶（DDC）5 种动物模型。                    观察肝脏组织的病理变化并采集病理图片。
            CCl 4 诱导 ALI 模型简便易操作、可重复性好、死亡                      1.2.7   免疫组织化学（IHC）染色检测
            率较低，与人类肝脏疾病在病理生理方面上相似度                                 肝组织脱 水：脱水 用的乙醇 体积分数从
            更高，是经典的化学性肝损伤模型，因此，本文采                             70%→75%→80%→90%→95%（各 1 h）→无水乙醇
            用 CCl 4 诱导法进行造模       [19-20] 。                    （30 min）→无水乙醇（30 min），即由低体积分数
                 实验动物为 SPF 级 SD 雄性大鼠 50 只，6 周龄                 逐步到高体积分数包埋后制成蜡块，将包埋组织的
            （辽宁长生生物技术股份有限公司），体质量(200±                          蜡块固定在切片机上，修块，切片（厚度 5  μm），
            20) g，适应性喂养 7 d 后开始实验。饲养在温度(24±2)                  经二甲苯脱蜡 3  次，每次 5 min。然后经过无水乙
            ℃、相对湿度 55%~65%、12 h 光照/12 h 黑暗的环                   醇（体积分数 95%、85%、75%）复水，每梯度 1 min，
            境中，自由饮水进食。动物实验设计得到湖北民族                             双蒸馏水浸泡 1 min，用 PBS 洗涤后，用 SABC-POD
            大学伦理委员会批准〔（2021）57〕。                               试剂盒淬灭失活组织内源性过氧化物酶，再经枸橼
                 将 SD 大鼠随机分为 6 组：空白对照组、模型                      酸盐进行抗原修复，质量分数 5%的牛血清白蛋白抗
            组（CCl 4 诱导，未用药）、联苯双酯（LBSZ，100                      原封闭；一抗、二抗孵育，DAB 显色试剂盒显色后
            mg/kg，以 SD 大鼠体质量为基准，下同）组、PSPJ                      进行苏木素复染，同上步骤经梯度乙醇、二甲苯脱
            低剂量（50 mg/kg）组、PSPJ 中剂量（100 mg/kg）                 水，中性树脂封片后正置光学显微镜下观察拍照。
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