Page 147 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 陈 赟，等: 高酶活性 β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖 ·2459·

在 pH 4~10 下，37 ℃孵育 60 min，突变体 较 小 ， 最后稳 定在 0.20 nm 附 近，而 突变 体
ManBl(I91N/L211I)的 pH 稳定性均高于 ManBl，特 ManBl(I91N/L211I)的 RMSD 波动较大，最后稳定在
别是在 pH 5~10 下，突变体 ManBl(I91N/L211I)的剩 0.25 nm 附近。结果表明，突变位点的引入使蛋白构
余相对酶活性均高于 80%（图 2c），说明该突变体的 象波动较大，即柔性更大。较大的柔性可能使酶分
pH 稳定性提高。为研究酶的激活剂和抑制剂，7 种 子具有更高的催化活力，但同时其结构紧凑型、稳
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10 mmol/L 金属离子（K 、Mn 、Zn 、Ca 、Na 、 定性会受到一定程度的影响。
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Cu 、Mg ）逐一加入酶缓冲液液中，结果表明，7 回旋半径（R g ）代表蛋白整体结构的紧凑程度。
种金属离子对突变体 ManBl(I91N/L211I)的活性均有 图 4 为 ManBl 和突变体 ManBl(I91N/L211I)的 R g 。
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所抑制，Cu 、Ca 、Zn 抑制了将近 40%的相对酶
活性（图 2d）。
在最适条件下，测得 ManBl 和突变体 ManBl
(I91N/L211I) 的比酶活性分别为 3750.0 和
15554.7 U/mg，突变体 ManBl(I91N/L211I)的比酶活性
是野生型的 4.1 倍。分子进化是提高酶活性的有效策
略，这与其他研究结果一致 [2,12] ，如来源于 Bacillus sp.
MK-2 的 β-甘露聚糖酶在 T112R、L211I 或 K291E 的
[2]
3 个氨基酸残基单位点突变均能提高其酶活性 ，且
在 3 个氨基酸位点的联合突变使其酶活性提高至
9003 U/mg，均高于单氨基酸位点或双氨基酸位点的 图 4 ManBl 及突变体 ManBl(I91N/L211I)的 R g
酶活性 [12] 。 Fig. 4 R g of ManBl and mutant ManBl(I91N/L211I)

2.4 β-甘露聚糖酶及其突变体的分子动力学及分
由图 4 可见，突变体 ManBl(I91N/L211I)的 R g
子对接
略大于野生型，表明突变位点的引入在一定程度上造
本文的 β-甘露聚糖酶 ManBl 与 B. licheniformis 成蛋白结构更为松散，使其稳定性降低，但同时有可
DSM13 的 β-甘露聚糖酶 ManB 的氨基酸序列相似性 能使得底物结合口袋更为扩张、打开，有利于底物分
为 100% [1,40] ，与 BCman-GH26（PDB 编码：2QHA）
子的进入并发生催化。
一致性达 82.14%，以此为基础进行同源建模预测 β-
均方根波动（RMSF）代表蛋白氨基酸残基的波
甘露聚糖酶的三维结构，图 3 为 ManBl 及突变体
动情况。图 5 为 ManBl 及突变体 ManBl(I91N/L211I)
ManBl(I91N/L211I)动力学过程的方根偏差（RMSD） 的 RMSF 曲线。
曲线，RMSD 体现蛋白质原始构象与在特定时间其
结构的平均偏差。

图 5 ManBl 及突变体 ManBl(I91N/L211I)的 RMSF 曲线

Fig. 5 RMSF curves of ManBl and mutant ManBl(I91N/L211I)
图 3 ManBl 及突变体 ManBl(I91N/L211I)动力学过程的
RMSD 曲线 由图 5 可知，突变体 ManBl(I91N/L211I)氨基酸
Fig. 3 RMSD curves of ManBl and mutant ManBl(I91N/L211I) 残基波动整体上要高于野生型蛋白，尤其是图中红圈
kinetic processes
所示区域，且区域 2、3 位于催化残基附近。说明突
从图 3 可知，2 种蛋白的 RMSD 波动均较为平 变位点的引入虽然不直接作用于底物分子的结合，但
缓，尤其是 20 ns 后，野生型和突变体 RMSD 均趋 其可以通过远程作用，间接导致催化口袋区域柔性增
于稳定。但比较而言，野生型 ManBl 的 RMSD 波动 加。而结合口袋柔性的增加，与酶活力提高有显著正