Page 143 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 陈 赟，等: 高酶活性 β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖 ·2455·

应用于造纸和制浆工业，可提高漂白纸浆的亮度， 1 实验部分
降低纸浆漂白过程中的卡帕数和化学物质的含量，
并可回收利用椰子和咖啡废料 [2,4] ；此外，应用于洗 1.1 试剂与仪器
[5]
涤业，可有效去除污渍 ；应用于食品工业，可降 Fastpfu、EasyTaq、dNTP、DNA Marker、蛋白
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低咖啡提取物的黏度等 。 Marker、dTTP、dCTP、dATP、dGTP、MgCl 2 ，AR，
β-甘露聚糖的水解产物为甘露寡糖（MOS），含 北京全式金生物技术有限公司；无缝克隆试剂盒和
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2~12 个甘露单糖 。MOS 作为非降解性寡糖，能够促 退火缓冲液，AR，上海生工生物工程有限公司；寡
进乳杆菌（Lactobacilli）和双歧杆菌（Bifidobacteria） 核苷酸引物，AR，英潍捷基（上海）贸易有限公司
[2]
等有益菌的生长，并能抑制致病微生物的繁殖 ； 合成；KGM，BR，湖北惠葡有限公司；3,5-二硝基
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MOS 也是一种对人类健康有益的功能性食品 。基 水杨酸（DNS，BR）、D-甘露糖（BR）、刚果红染
于 MOS 的重要性及市场需求，建立一种简便且经济 料（BR）、琼脂粉（BR）、Lowry kit 试剂盒（AR）、
有效的 MOS 制备方法尤显重要。魔芋胶（KGM） 三(羟甲基)氨基甲烷（Tris，AR），北京索莱宝科技
是一种可食用纤维，用作食品和饮料中低值的凝胶 有限公司；琼脂糖，AR，Biowest Agarose 公司；酵
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剂和增稠剂 。因此，将低值 KGM 转化成高值 MOS 母粉、蛋白胨、胰蛋白胨，AR，OXOID 公司；甘
具有重要意义。尽管已报道了多种不同特性的 β-甘 露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六
露聚糖酶 [2,10-11] ，如来源于 Bacillus sp. MK-2 的 β- 糖，AR，上海惠诚生物科技有限公司；NaCl、
甘露聚糖酶突变体 MEIR 和 Bacillus sp. CFR1601 KH 2 PO 4 、MgSO 4 •7H 2 O、KCl、MnCl 2 ，BR，国药集
的 β-甘露聚糖酶， 酶 比活性分 别 为 9003.1 和 团化学试剂有限公司。
10461.5 U/mg [12-13] ，是目前报道酶活性较高的 β-甘 Biometra Tone 梯度 PCR 仪，德国耶拿公司；
露聚糖酶，但仍难以满足精细化工行业的需求。因 Quantity One 凝胶成像系统，美国 BioRad 公司；
此，需要筛选更高酶活性和稳定性较佳的酶。为了 BIFUGE STRATOS 全能台式高速冷冻离心机，美国
提高酶产量，对 β-甘露聚糖酶基因进行了异源表达， Thermo Scientific 公司；ÄKTA 色谱系统，美国 GE
包括大肠杆菌（E. coli）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、 公司； SpectraMaxm i3x 多功能酶 标仪， 美国
植物乳杆菌（L. plantarum）、酿酒酵母（S. cerevisiae） Molecular Devices 公司；1260 液相色谱仪，美国
和毕赤酵母（P. pastoris）等 [2,14-15] 。然而，这些表 Agilent 公司；CHB-202 恒温金属浴，杭州博日科技
达系统通常是建立在抗生素筛选表达系统上，限制 有限公司。
了其在食品和养殖业中的应用。因此，只有筛选高 1.2 菌株、质粒、引物及培养基
酶活性的 β-甘露聚糖酶，并建立其食品级表达系统， 从河北科技 大学校园土 壤中分离得 到 B.
才能满足在食品及养殖业中无抗生素残留的要求。 licheniformis KD-1 菌株，目前保存于中国普通微生物
食品级表达系统是指所选菌株应为食品安全的微生 菌种保藏管理中心（CGMCC 编号 18964）；B. subtilis
物，并且不应使用抗生素筛选标记 [16-17] 。B. subtilis 是 DB104 和质粒 pWB980 为 WONG 教授赠送 [21-22] ，其
[18]
革兰氏阳性细菌，一般被认为是安全生物（GRAS） ， 他质粒和菌株见表 1 和表 2，所用引物见表 3。
其具有强大的分泌能力及培养鲁棒等优点，常被用
表 1 本文所用质粒
作细胞工厂或合成生物学的底盘细胞生产酶和化学 Table 1 Plasmids used in this paper
产品 [19] 。但应用 B. subtilis 食品级表达的酶仅见阿
质粒 备注 参考文献
洛酮糖异构酶和含铁酸性脲酶 [18,20] ，有关 β-甘露聚
pWB980 [21]
糖酶的食品级表达鲜见报道。
pHT-XCR6 [23]
本文拟从地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）中克
pcrF11 [23]
隆该 β-甘露聚糖酶基因 manBl，并通过易错 PCR 对 pWB-manBl pWB980 携带 manBl 基因 [24]
该酶进行定向进化，筛选高酶活性的突变体；其次， pWB-MBM1 pWB980 携带 manBl(Y247D/T272M) 本文
应用 CRISPR/Cpf1 技术无痕敲除 B. subtilis D-丙氨 基因
酸变位酶基因 dal，将 B. subtilis 载体的抗生素基因 pWB-MBM2 pWB980 携带 manBl(S96G)基因 本文
替换为 dal 基因，构建基于 dal 基因互补的 B. subtilis pWB-MBM3 pWB980 携带 manBl(I91N/L211I)基因 本文
食品级表达系统；最后，应用该酶进行 MOS 的制备。 pWB-DMBM3 pWB-MBM3 食品级载体 本文
本研究旨在筛选高酶活性的 β-甘露聚糖酶，建立其 pdal1 pcrF11 携带 dal 靶 DNA 本文
食品级表达系统，并应用该酶将低值 KGM 转化为 pdal2 pdal1 在 Pst Ⅰ和 Hind Ⅲ位点处插 本文
入 dal 同源臂
高值 MOS。