Page 144 - 《精细化工》2023年第11期

·2456· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

表 2 本文所用菌株 为模板，对 manBl 基因进行易错 PCR，PCR 缓冲
Table 2 Strains used in this paper 溶液 中包 含 1 mmol/L dTTP/dCTP、0.2 mmol/L
菌株 备注 参考文献 dATP/dGTP、6.8 mmol/L MgCl 2 、0.3 mmol/L KCl、
B. subtilis DB104 His、nprR2、nprE18、ΔaprA3 [22]
0.5 mmol/L MnCl 2 、0.2 µmol/L P1、0.2 µmol/L P2 和
B. licheniformis KD-1 [24] 4
1.0×10 U/L EasyTaq。PCR 程序为 95 ℃预变性
B. subtilis XCR6 B. subtilis DB104(pHT-XCR6) 本文
5 min；94 ℃/30 s；55 ℃/30 s；72 ℃/2 min，35
B. subtilis DBFG-1 B. subtilis DB104 Δdal 本文
次循环；72 ℃/10 min。以 P3 和 P4 为引物，对质
B. subtilis DB104 本文
(pWB980) 粒 pWB-manBl 通过 PCR 进行线性化。参照文献[25]
B. subtilis MTV13 B. subtilis DB104(pWB-manBl) 本文 方法，采用 POE-PCR 方法将上述两种 PCR 产物进
B. subtilis YM40 B. subtilis DB104(pWB-MBM1) 本文 行融合，形成 DNA 片段多聚体，POE-PCR 条件为
B. subtilis YM70 B. subtilis DB104(pWB-MBM2) 本文 94 ℃/30 s；55 ℃/30 s；72 ℃/7 min，35 次循环。
B. subtilis YM102 B. subtilis DB104(pWB-MBM3) 本文 参照文献[26]方法，将获得的 POE-PCR 产物转
B. subtilis FGYM102 B. subtilis DBFG-2(pWB-DMBM3) 本文
化至 B. subtilis DB104 感受态细胞。转化子（所含

表 3 本文所用引物 有的质粒标记为 pWB-MBMn，n 为 1、2、3……）
Table 3 Primers used in this paper 在含有质量分数 0.1%刚果红和质量浓度为 10 mg/L
引物 序列 5'-3' 卡那霉素的 LB 平板上进行初筛。具有较大透明圈
P1 GTTTCTCCGGTGAACCCGAATGCCCA 的克隆接种至 24 孔板，在 37 ℃、180 r/min 培养
P2 CGCCGTCCCATATCTCTCCTTTATTCA 12 h，并测量各菌株的酶活性进行第二次筛选，将
P3 TGAATAAAGGAGAGATATGGGACGGCG
酶活性提高 5%的菌株进行测序，并进行摇瓶发酵。
P4 TGGGCATTCGGGTTCACCGGAGAAAC 1.3.2 dal 基因敲除质粒的构建
P5 CTGGCACAAAAAGCCGTCTCTGTAC
P6 CTCCATTTAGGTAAGTACGACACTTCCTAGC 根据 CRISPOR〔CRISPOR（tefor.net）〕在线软
TTTTATTC 件设计 dal crRNA 序列 [27] 。一对 27 nt dal-crRNA-F
P7 CTAGGAAGTGTCGTACTTACCTAAATGGAGA 和 dal-crRNA-R 寡核苷酸（10 μmol/L)，经退火，形
ATTCATAAAAC [23]
P8 CTTTTAGTGTGTCAGTCCACAGTTGG 成 23 bp 的双链及 5'端有 4 nt 的突出末端分子 ，
P9 TGAACTGATTCAAGCAAGCTTGTTCTCACG 接着将该退火产物稀释 10 倍，与经 Eco31Ⅰ酶切的
CCGTCTTTAAATAAG
pcrF11 进行连接，构建 pdal1 质粒。以 B. subtilis
P10 TCTGCCGTTCGACGATCTGCAGTCTATTTGA
GCAACCTGCAAATATGTC DB104 基因组 DNA 为模板，分别以 P5 和 P6 为引
P11 CGCGGATCCTCTATTTGAGCAACCTGCAAAT 物，P7 和 P8 为引物，分别扩增 dal 基因上、下游 1
ATGTC
kb 同源臂，应用 P9 和 P10 为引物，将 dal 基因上、
P12 GTGAATGGACCAATAATAATGAGCACAAAA
CCTTTTTACAG 下游同源臂进行融合 PCR，并与 PstⅠ和 Hind Ⅲ酶
P13 GCTGAACAGATTAATAATAGATTTTAATTGCT 切的 pdal1 质粒进行连接，构建质粒 pdal2。
TATATTTACCTG
1.3.3 枯草芽孢杆菌食品级表达系统的构建
P14 CATTATTATTGGTCCATTCACTATTC
应用 CRISPR/Cpf1 技术敲除 B. subtilis DB104
P15 CAGGTAAATATAAGCAATTAAAATCTATTATT
AATCTGTTCAGC dal 基因 [23,28] 。将 pHT-XCR6 和 pdal2 质粒转入 B.
P24 CCCAAGCTTGTTCTCACGCCGTCTTTAAATAAG subtilis DB104 感受态细胞，加入质量浓度为 30 g/L
P16 ATGAGCACAAAACCTTTTTAC 的木糖诱导 8 h 以便敲除 dal 基因 [23] ，构建 B. subtilis
P17 TTAATTGCTTATATTTACCTG
DBFG-1 食品级表达系统。以 P5 和 P11 为引物，转
dal-crRNA-F AGATGATGAAGCGATTTCACTGCGCAA
dal-crRNA-R AATTTTGCGCAGTGAAATCGCTTCATC 化子基因组为模板，进行 PCR，鉴定 dal 基因是否
敲除。质粒丢失按文献[23]方法进行。
种子培养基（均为质量浓度）：胰蛋白胨 10 g/L、 采用 POE-PCR 方法构建 manBl(I91N/L211I)基
酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。 因的食品级表达质粒 pWB-DMBM3。首先，以 P12
发酵培养基（均为质量浓度）：KGM 5 g/L、蛋 和 P13 为引物，B. subtilis 基因组 DNA 为模板，克
白胨 5 g/L、KH 2 PO 4 1 g/L、MgSO 4 •7H 2 O 0.1 g/L， 隆 dal 基因；以 P14 和 P15 为引物，pWB-MBM3 为
pH 7.0。 模板，扩增载体骨架；两种 PCR 产物进行 POE-PCR，
1.3 方法 并将 PCR 产物转化入 B. subtilis DBFG-1 感受态细
1.3.1 β-甘露聚糖酶基因随机突变及筛选 胞，获得 manBl(I91N/L211I)基因的食品级表达系统
以 P1 和 P2 为引物，以 B. licheniformis KD-1 B. subtilis FGYM102。以 P16 和 P17 为引物，鉴定