Page 77 - 《精细化工》2023年第11期

第 11 期 刘佳林，等: 冷冻研磨对胶原蛋白分子结构及性能的调控 ·2389·

磨过程可能会局部过热，导致少部分胶原蛋白肽链 原蛋白的 CD 图发现，不同预冻时间处理后的胶原
结构受到影响，极少部分肽链断裂为小分子片段或 蛋白样品负吸收峰最低值和正吸收峰最高值并没有
者三螺旋结构解旋；而 5 号（预冻 12 h）和 6 号（预 呈现规律性变化，说明冷冻研磨后胶原蛋白的立体
冻 24 h）泳道下方则基本无小分子条带，这说明预 构造未发生显著改变，胶原蛋白的三螺旋结构也并
冻足够的时间后再研磨，并不会影响胶原蛋白分子 未受到严重破坏，各样品的具体结构变化需进一步
间的相互作用力，样品的肽链结构保持不变。这可 计算 rpn 值（胶原蛋白 CD 谱中正吸收峰和负吸收
能是因为冷冻时间足够长可以更好地分散研磨产生 峰强度比值的绝对值 [28] ）。
的热量，因此不会对胶原蛋白的肽链结构造成影响。
2.2 红外光谱分析
图 2 是不同冷冻时间处理的牛跟腱胶原蛋白样
品的红外谱图。图中各样品均出现了Ⅰ型胶原蛋白典
型的酰胺 A、B 带以及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带的吸收峰 [26] 。
–1
天然胶原蛋白 COL 的酰胺Ⅱ带（1544.47 cm ）波
–1
数均比研磨胶原蛋白样品 COL3h（1539.6 cm ）、
–1
–1
COL6h（1538.60 cm ）、COL12h（1538.13 cm ）、
–1
COL24h（1538.00 cm ）高，而胶原蛋白中酰胺Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ带与胶原蛋白的多肽链结构构型及有序程度有
关 [26] 。对比 FCOL 发现，冷冻时间对酰胺Ⅰ、Ⅱ、
图 3 不同预冻时间处理的胶原蛋白样品的 CD 谱图
Ⅲ带的值几乎无影响。因此，冷冻时间对胶原蛋白 Fig. 3 CD spectra of collagen samples treated at different
的天然结构几乎无影响，这与前面 SDS-PAGE 结果 pre-freezing time
一致。样品 COL3h、COL6h、COL12h 和 COL24h
通过 rpn 值可以有效地判断胶原蛋白是否具有
仅酰胺 A 带发生红移，红移主要原因推测来自于研
完整的三螺旋构象 [29-30] 。研究表明，当 rpn 值范围
磨，可能在机械力研磨作用下，胶原蛋白分子间的
在 0.12~0.15 之间时，胶原蛋白具有完整的三螺旋构
氢键作用发生改变，导致极少部分三螺旋解旋或者
象。不同预冻时间研磨处理的胶原蛋白样品 rpn 值
是肽链结构被破坏，使胶原蛋白蛋白多肽链的有序
见表 1。
性发生一定变化。

表 1 不同预冻时间研磨处理的胶原蛋白样品的 rpn 值
Table 1 rpn Values of collagen samples ground at different
pre-freezing time
样品名称 平均 rpn 值 误差
COL 0.132 ±0.023
FCOL 0.127 ±0.009
COL3h 0.110 ±0.007
COL6h 0.105 ±0.008
COL12h 0.116 ±0.011

COL24h 0.123 ±0.007
图 2 天然牛跟腱胶原蛋白与研磨处理后的胶原蛋白样

品的红外谱图 由表 1 可知，COL 的 rpn 值为 0.132，FCOL 的
Fig. 2 FTIR spectra of natural bovine heparin collagen and
ground collagen samples rpn 值为 0.127，说明天然胶原蛋白与单纯冷冻的胶
原蛋白在结构上均保持了完整的三螺旋构象，进一
2.3 CD 分析 步印证了单纯冷冻对天然胶原蛋白结构无影响。
胶原蛋白的所有应用都以保持胶原蛋白的三螺 COL3h、COL6h 和 COL12h 的 rpn 值分别是 0.110、
旋结构为前提。图 3 是不同冷冻时间研磨的牛跟腱 0.105 和 0.116，三螺旋结构含量与对照样品 COL 和
胶原蛋白的 CD 谱图。从图 3 可以观察到，各胶原 FCOL 相比略有减少，说明短时间冷冻再研磨对三
蛋白样品均在 198 nm 附近出现一个较强的负吸收 螺旋结构不利，可能会有少量三螺旋结构解旋或者
峰，在 223 nm 处存在一个较弱的正吸收峰，这是Ⅰ 肽链断裂，这与 SDS-PAGE 的实验结论互相吻合。
型胶原蛋白典型的三螺旋结构特征 [27] 。对比天然胶 COL24h 的 rpn 值是 0.123，与对照样品更为接近，