Page 76 - 《精细化工》2023年第11期
P. 76

·2388·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

                                                                                         –1
                                                                             –1
            子三螺旋构象的变化。用冰乙酸溶解牛跟腱胶原蛋                             3 min 内从 0.1 s 升到 1000 s ，实验温度为 10  ℃
            白样品后透析 72 h（透析条件：在 4  ℃、pH=7.4                     （以避免样品自组装）。每个样品重复 3 次取平均
            的 PBS 缓冲液中透析 72 h，间隔 3~4 h 更换透析液，                  值。
            透析袋截留分子量 14000），将透析完全的样品用                          1.4.6   促细胞增殖性能测试
            PBS 稀释成质量浓度 0.1 g/L 的溶液，然后进行 CD                        将胶原蛋白样品用 0.5 mol/L 乙酸溶解成 2 g/L
            扫描测试。扫描温度 15  ℃，波长范围 190~250 nm，                   胶原蛋白乙酸溶液，透析（同 1.3.3 节透析方法）至
            扫描速率 50 nm/min，扫描精度 0.5 nm。                        中性。样品中加入质量分数为 3%的双抗（青霉素和
            1.4   样品性能测试                                       链霉素，质量比为 1∶1）溶液，配制浓度为 1×10                   5
            1.4.1   原子力显微镜（AFM）测试                              个/mL 的细胞悬液（小鼠的成纤维细胞 NIH/3T3），
                 称取适量冷冻研磨牛跟腱胶原蛋白样品用                            按 3000~5000 个细胞/每孔接种于 96 孔板中，每孔
            0.5 mol/L 冰乙酸溶液溶解后透析（透析条件同 1.3.3                   加 100 μL 双抗溶液，将上述 96 孔板置于 CO 2 （5%，
            节），配制成质量浓度 0.02 g/L 溶液。取 5  μL 滴在                  体积分数）培养箱中（37  ℃）培养 24 h 以贴壁。
            云母片中间平铺一薄层至自然干燥 2 h。将所有滴有                          继续培养 24 h 后分别加入 200 μL DMEM 培养基与
            样品的云母片放置于隔水式恒温培养箱（36  ℃）内                          200 μL 胶原蛋白样品。每个样本设 9 个重复，按实
            培养 24 h。使用原子力显微镜观察胶原蛋白纤维形貌。                        验设计培养一定时间。分别取培养 1、3 和 5 d 后的
            1.4.2   扫描电子显微镜（SEM）测试                             样品，向所有孔中加入 20 μL MTT 溶液，培养箱中
                 通过 SEM 观察胶原蛋白样品组装后的纤维表                        孵育 1~4 h。 吸除上 清液 ，每孔 加二 甲基亚 砜
            面形态及粒径。取胶原蛋白样品 5 mL 至离心管内，                         （DMSO）200  μL，摇床摇匀，使用酶标仪测定
            36  ℃（胶原蛋白组装温度）下放置于隔水式恒温箱                          490 nm 处吸光度，吸光度越高意味着促细胞增殖能
            内孵育 12 h，胶原蛋白溶液组装为凝胶纤维，离心                          力越好。
            （离心力 10000 g）后除去上清液，沉淀部分（组装
                                                               2   结果与讨论
            后的纤维）用去离子水 1~2 mL 洗 2~3 次再次离心，
            获得的组装纤维用于测试纤维形态及粒径。纤维粒
                                                               2.1  SDS-PAGE 分析
            径的测量与统计：借助 Nano measurer 软件测量 SEM
                                                                   通过 SDS-PAGE  研究了冷冻和冷冻研磨处理
            图中各胶原蛋白纤维粒径。每个样品选取不同区域
                                                               对胶原蛋白分子结构的影响，如图 1 所示。
            的 5 张图，统计 100 根纤维直径数据，得到纤维粒
            径分布柱状图，计算平均粒径和标准偏差。
            1.4.3   溶解度实验
                 在 4  ℃下，称取研磨样品（质量记为 m 1 ，mg）
            加入 10 mL 去离子水（pH=7）并搅拌 12 h。将获得
            的分散体在 6000 r/min 下离心 5 min，以分离未溶解
            的胶原蛋白，80~90  ℃干燥 6 h 后称量胶原蛋白质
            量（记为 m 2 ，mg）。胶原蛋白的溶解度由公式（1）
            计算得到。
                        溶解度/(g/L)=(m 1 –m 2 )/10       （1）
                                                               0—标准品；1—COL；2—FCOL；3—COL3h；4—COL6h；5—
            1.4.4   热稳定性（DSC）分析                                COL12h；6—COL24h
                 准确称取 10 mg 研磨牛跟腱胶原蛋白样品，加                      图 1   不同预冻时间牛跟腱胶原蛋白样品的 SDS-PAGE
            入 400 μL 0.5 mol/L 乙酸溶液充分溶胀（4  ℃，2 d）                   谱图
            至样品呈均一透明状          [19] ，使用差示扫描量热仪检测               Fig. 1    SDS-PAGE spectrum of bovine achilles tendon collagen
                                                                     samples with different pre-freezing time
            冷冻研磨牛跟腱胶原蛋白样品的热变性温度以及热
            变焓值差异。测定条件为：空铝盒为空白对照，升                                 所有泳道显示清晰的 α1、α2 和 β 条带，这是典
            温速率为 5  ℃/min，扫描温度范围为 20~60  ℃，氮                   型的Ⅰ型胶原蛋白电泳图            [25] 。整体而言，冷冻研磨
            气流量 20 mL/min。                                     后样品与对照 COL 无显著性差异，说明冷冻研磨不
            1.4.5   黏度测试                                       会对胶原蛋白的立体结构产生严重的破坏作用。对
                 使用旋转流变仪对研磨牛跟腱胶原蛋白进行黏                          比不同预冻时间可以发现，液氮冷冻 3 和 6 h 样品
            度测试，选择平行板夹具，夹具直径大小为 40.0 mm，                       即 3 号、4 号泳道，在 100 kDa 下方均出现了少量
            测试间隙为 0.6 mm。测试频率为 1 Hz，剪切速率在                      颜色较浅的降解带，这可能是因为预冻时间短，研
   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81