Page 75 - 《精细化工》2023年第11期
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第 11 期                    刘佳林，等:  冷冻研磨对胶原蛋白分子结构及性能的调控                                   ·2387·


            3D 生物打印和药物缓释材料等，具有其他替代材料                           司；磷酸盐缓冲（PBS）溶液，吉诺生物技术有限
            无可比拟的优越性         [4-6] ，同时胶原蛋白还具有良好的               公司；过硫酸铵、丙烯酰胺、1.5 mol/L  Tris-HCl、
            生物降解性与生物相容性             [7-12] 。随着人们对胶原蛋           考马斯亮蓝 R-250 的四甲基二乙胺（TEMED）溶液
            白利用的日趋广泛，各行业对胶原蛋白的需求量和                             （浓度 1.9 mol/L）、SDS 蛋白上样缓冲液〔7.5%（体
            物性要求逐渐变高。通常，胶原蛋白原料是以固体                             积分数）分离胶和 4%（体积分数）浓缩胶（分离胶
            海绵形式来储存的，但是，固体海绵并不是胶原蛋                             和浓缩胶均为混合物，包含水、质量分数 30%丙烯
            白应用的主要形式，胶原蛋白粉末或者溶液才是胶                             酰胺溶液、1.5 mol/L Tris-HCl、质量分数 10% SDS、
            原蛋白作为添加剂或者对胶原蛋白进行溶液加工的                             质量分数 10%过硫酸铵）〕，武汉博士德生物工程有
            初始原料     [13-14] 。然而，胶原蛋白难溶于水，易溶于                  限公司；DMEM 培养基（含质量分数 10%胎牛血清
            稀酸，但在酸性溶液中，胶原蛋白分子会慢慢降解；                            的高糖培养基）、MTT（M8180）试剂盒，北京索莱
            而把酸性胶原蛋白溶液透析成中性，这种中性胶原                             宝科技有限公司；青霉素-链霉素混合液，南京赛博
            蛋白分散体的制备过程不仅繁琐，同时降低了体系                             生物科技有限公司。
            的热稳定性      [1,15] 。                                    LGJ-10D 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；
                 近年来，随着胶原蛋白的应用范围不断拓展，                          MM400 冷冻混合球磨仪，弗尔德（上海）仪器设备
            各应用领域对胶原蛋白的物性要求，特别是溶解性                             有限公司；GHP-9050 隔水式培养箱，上海一恒科学
            要求进一步提升。在大部分应用领域，都要求制备                             仪器有限公司；DYCZ-25D 双垂直电泳仪，北京六
            得到的胶原蛋白样品具有良好的易溶性和速溶性，                             一仪器厂；Tanon-4100 凝胶成像系统，上海市天能科
            以提高操作的便捷性。但是，由于天然胶原蛋白的                             技有限公司；J-810 圆二色谱仪，日本 JASCO 公司；
            高分子构造，使其在常规溶剂中往往存在难溶或溶                             NEXUS 傅 里叶变换红 外光谱仪， 美国 Thermo
            解时间长的特性。在天然材料如胶原蛋白领域，机                             Nicolet 公司；S-3000N 扫描电子显微镜，日本 Hitachi
            械力，如：剪切力、离心力、超声、超高压、研磨                             公司；AFM MultiMode8 原子力显微镜，德国 Bruker
            等，常被用于对胶原蛋白的改性处理或者调控其体                             公司；DHR-1 旋转流变仪、DSC Q2000 差示扫描量
            外组装过程      [16-18] 。其中，研磨还可以作为提高胶原                 热仪，美国 TA 公司；DR-200Bs 酶标检测仪đ೶ת
            蛋白溶解性的有效手段，它是利用机械能来诱发化                             Ѱ॓॓࿐၎ఖႵཋ܄ඳb
            学反应或引发材料组织、结构和性能变化，并以此                             1.2   牛跟腱胶原蛋白样品的制备
            来制备新材料的方法          [19-20] 。但是，常规的研磨粉碎                 先将牛跟腱胶原蛋白在液氮中预冻，预冻时间
            方法，在粉碎过程中不可避免地使样品升温，从而极                            分别为 3、6、12 和 24 h，依次命名为 COL3h、COL6h、
            容易导致胶原蛋白的热变性，使其失去天然活性                      [18] 。   COL12h、COL24h。然后运用冷冻混合球磨仪依次
                                                               研磨，研磨条件：频率 25 Hz，研磨时间均为 5 min，
                 为避免胶原蛋白在加工过程中的这种变化，本
                                                               装载量为 800 mg。
            文首次将其预先冷冻再研磨（简称冷冻研磨）用于
                                                                   对照样品 1：天然、未经冷冻研磨处理的牛跟腱
            粉碎和调控材料性能。因此，将冷冻研磨技术直接
                                                               胶原蛋白命名为 COL。对照样品 2：天然牛跟腱胶原
            应用于天然牛跟腱胶原蛋白粉碎，通过调节冷冻时
                                                               蛋白经液氮冷冻 24 h，不使用研磨处理命名为 FCOL。
            间后再研磨制备胶原蛋白粉末。运用凝胶电泳
                                                               1.3   结构表征
            （SDS-PAGE）、圆二色谱（CD）及红外光谱等方法
                                                               1.3.1   凝胶电泳
            对上述胶原蛋白粉末进行结构研究；在此基础上，
                                                                   参考文献[23-24]方法进行 SDS-PAGE 实验。体
            研究冷冻研磨对样品的水溶性、热稳定性、黏度和
                                                               积分数 7.5%分离胶 10 mL、体积分数 4%浓缩胶
            细胞增殖能力的调节作用，为胶原蛋白在伤口愈合
                                                               6 mL、胶原蛋白标品进样量 10 μL、样品加样量 15
            敷料、药妆、再生医学和临床医用材料等方面的应                             μL；结束电泳后用脱色液（体积分数 7.5%冰乙酸和
            用提供理论支持        [21-22] 。
                                                               体积分数 5%甲醇）浸泡至样品出现清晰条带，使用
            1   实验部分                                           凝胶电泳成像系统拍照分析。
                                                               1.3.2   红外光谱分析
            1.1   试剂与仪器                                            利用傅里叶变换红外光谱仪检测冷冻研磨牛跟
                 牛跟腱胶原蛋白，河北考力森生物科技有限公                          腱胶原蛋白结构的变化。取样品粉末压片，扫描波
                                                                                                –1
                                                                                –1
            司；冰乙酸、甲醇、十二水磷酸氢二钠、二水磷酸                             数范围 4000~400 cm ，扫描分辨率 4 cm ，扫描 16 次。
            氢二钠，AR，国药集团化学试剂有限公司；胶原蛋                            1.3.3  CD 测试
            白标品（Marker），赛默飞世尔科技（中国）有限公                             采用 CD 仪观察冷冻研磨后牛跟腱胶原蛋白分
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