Page 118 - 《精细化工》2023年第12期
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·2660·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

                               [9]
            化学发光免疫测定法 、表面增强拉曼散射法                     [10] 等。   的分析检测，旨在实现 ENR 的高效检测分析。
            然而，这些传统方法通常具有耗时长、成本高、操
                                                               1   实验部分
            作过程复杂或灵敏度低等缺陷，难以满足实际抗生
            素残留检测的高标准要求。因此，迫切需要发展新
                                                               1.1   试剂与仪器
            型检测方法，以实现 ENR 的高效检测分析。
                                                                   三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP，质量分数 98%）、
                 作为一种新型的分析检测手段，电化学生物传
                                                               巯基己醇（MCH，体积分数 97%）、亚铁氰化钾（质
            感器因具有响应速度快、成本低、灵敏度高、操作                             量分数 99%），北京百灵威科技有限公司；ENR（标
            简单且易于微型化等优点而广受关注                  [11-12] ，在抗生
                                                               准品）、Hemin（质量分数 95%）、4-羟乙基哌嗪乙磺
            素残留检测领域表现出较大潜力 。                                   酸（HEPES，质量分数 99.5%）、KCl（质量分数
            GALLEGOS-TABANICO 等      [13] 以分子印迹聚合物为
                                                               99.5%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TdT
            识别元件，构建了一种便携式 ENR 电化学生物传感                          （20000 U/mL），纽英伦生物技术（北京）有限公司；
            器；ZHANG 等    [14] 基于 DNA 核酶设计 DNA 步行器，
                                                               TMB 显色液，上海碧云天生物技术有限公司；dATP
            构建了一种新型 ENR 残留电化学适体传感器。然
                                                               （100 mmol/L）、dGTP（100 mmol/L）、Parafilm 膜，
            而，现有 ENR 电化学生物传感器大多灵敏度较低或
                                                               上海生工生物工程股份有限公司；1.0、0.3 μm 氧化
            涉及复杂的 DNA 序列设计，限制了其在实际食品样
                                                               铝粉，武汉高仕睿联科技有限公司；无水乙醇
            品检测中的应用。因此，需建立新型电化学生物传
                                                               （C 2 H 5 OH）、浓硫酸（质量分数 98%）、ZnSO 4 ，分
            感器以实现 ENR 的简单快速、高灵敏和高特异性检
                                                               析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；过氧化氢
            测。
                                                               （H 2 O 2 ，质量分数 30%），分析纯，南京化学试剂
                 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是一种无需模
                                                               股份有限公司；超纯水，Milli-Q 纯化系统（Millipore
            板的 DNA 聚合酶，其催化寡聚核苷酸重复添加至单
                                                               公司，美国）制备；所有 DNA 探针，生工生物工程
            链 DNA 或双链 DNA 的 3'-OH 端，且延伸产物序列                    （上海）股份有限公司合成，DNA 序列如下所示：
            高度依赖于寡聚核苷酸池的组成                [15-17] 。当寡聚核苷
                                                                   S-DNA：5'-TTA GTG CCC TG-SH-3'
            酸池中只有单种脱氧核苷三磷酸（dNTP）时，TdT
                                                                   R-DNA：5'-CAG GGC ACT AAG GTA-3'
            催化 dNTP 重复添加至底物链末端，并产生单一多                              Aptamer：5'-GCT GTG TGA CTC CTG CAA
            聚核苷酸链      [18-23] 。当脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）与脱
                                                               GTC CGA CAT ACC TTA GTG CCC TGA TAT AAT
            氧腺苷三磷酸（dATP）的物质的量比为 3∶2 时，                         GTA ACA CTA TTG AGC AGC TGT ATC TTG TCT
            TdT 催化产生连续的 G-四链体序列             [24-26] 。G-四链体     CC-3'。
            是一种由富含鸟嘌呤的单链核酸通过氢键形成的，                                 CHI 660E 电化学工作站，上海辰华仪器有限公
            具有结构和构象多样化的特殊二级结构以及多元结                             司；TGL-18MS 台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪
            合活性，常作为氯化血红素分子（Hemin）的稳定                           实验室仪器有限公司；XWY 涡旋仪、MiniB-100 金
            剂 [27] 。G-四链体与 Hemin 结合形成的 G-四链体核                  属浴，杭州米欧仪器有限公司；FC-12DTD-22.5L 超
            酶具有辣根过氧化物酶活性，能够催化 3,3',5,5'-四                      声波清洗机，南京禾创科学仪器有限公司。
            甲基苯并咪唑（TMB）、2,2'-偶氮双二铵盐（ABTS）、                     1.2   金电极的预处理
            鲁米诺等底物产生氧化还原反应               [28] 。与传统酶相比，             首先，将金电极在磨砂纸上进行物理打磨；然
            G-四链体核酶因具有高热稳定性、易于合成与修饰                            后，将金电极在水虎鱼溶液〔V(浓硫酸)∶V(过氧化
            等优势而常用于构建生物传感器                [29-30] ，以实现各类       氢)=3∶1）〕中浸泡 5 min，以去除电极表面的有机
            目标物的分析检测         [31-32] 。                         物；接着，依次在 1.0、0.3 μm 氧化铝匀浆上进行抛
                 本研究拟基于 TdT 协同 G-四链体核酶设计信                      光，使金电极表面呈镜面状态；随后，分别用无水
            号放大策略来构建一种高灵敏的 ENR 检测方法。在                          乙醇和超纯水对金电极进行超声波清洗 10 min 以去
            ENR 存在的情况下，适体序列特异性识别 ENR，触                         除黏附在电极表面的氧化铝匀浆溶液，再用水虎鱼
            发双探针分离，使得电极表面产生带有 3'-OH 末端                         溶液浸泡 5 min；最后，在 0.5 mol/L 硫酸中进行电
            的 DNA 双链，诱发 TdT 扩增反应，并产生 G-四链                      化学扫描清洗后，再用超纯水彻底冲洗电极表面。
            体核酶纳米线，进而催化 TMB 产生信号放大，信号                          1.3  DNA 修饰与固定
            大小与 ENR 浓度成正相关，可实现 ENR 的高灵敏                            将预处理好的金电极浸泡于 1  μmol/L 的 S-DNA
            和高特异性检测。构建的传感检测方法简单快速，                             溶液中（10 mmol/L HEPES 缓冲液，含 100 mmol/L
            无需标签标记，且不涉及复杂的 DNA 链设计或繁琐                          KCl，1 mmol/L  TCEP，用于防止 S-DNA 之间形成
            的纳米材料合成过程。将本方法用于实际食品样本                             二硫键），于 37  ℃下静置 1 h，随后将电极浸泡在
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