Page 119 - 《精细化工》2023年第12期

第 12 期 王 乾，等: 基于末端脱氧核苷酸转移酶协同 G-四链体核酶的恩诺沙星检测方法 ·2661·

0.1 mmol/L MCH 水溶液中，同时用 Parafilm 膜密封 入 150 µL 亚铁氰化钾（质量分数 17.2%）和 150 µL
后置于通风橱中静置 20 min，使电极表面形成直立 ZnSO 4 （质量分数 53.5%）以沉淀蛋白质，并在
有序的 DNA 分子单层，同时防止非特异性吸附。 10000 r/min（15 ℃）下离心 10 min，收集上清液并
1.4 ENR 检测 稀释备用。将不同质量浓度（0.5、1、5、10、50 μg/L）
在离心管中将 ENR 适体序列（Aptamer，0.2 的 ENR 溶液加入处理好的牛奶样本中，采用所建
mmol/L，溶液为含 100 mmol/L KCl 的 10 mmol/L 立的电化学检测方法对 ENR 进行测定，并计算回
HEPES 缓冲液）和 R-DNA 探针（0.2 mmol/L，溶 收率。
液为含 100 mmol/L KCl 的 10 mmol/L HEPES 缓冲 1.6 电化学测量
液）各 20 μL 混合，于 95 ℃下恒温加热 5 min，随 采用电化学工作站进行电化学测量，三电极体
后在室温下冷却 1 h。然后，将 20 μL 不同质量浓度 系：修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参
（0.5、1、2、5、10、20、50、200 μg/L）的 ENR 比电极，铂电极为对电极。所有电化学测量均在室
溶液（溶液为含 100 mmol/L KCl 的 10 mmol/L 温下进行。电化学分析方法有计时电流法（I-t）、电
HEPES 缓冲液）加入离心管中，于室温下静置 40 化学阻抗法（EIS）与循环伏安法（CV）。在–0.4 V
min。静置完成后，将金电极浸泡于上述混合溶液中， 下测定 I-t 曲线，并在 G-四链体核酶催化氧化还原
在室温下静置 30 min，使释放出的 R-DNA 与 S-DNA 反应达到稳态后记录第 60 s 的电流值。EIS 测试是
进行互补杂交。随后，将金电极浸泡于 TdT 反应缓 在含 0.1 mol/L KCl 的 5 mmol/L [Fe(CN) 6 ] 3−/4− 溶液中
5
冲液（含有 2.0×10 U/L TdT、0.4 mmol/L dATP、 进行，相关参数为：频率为 0.1~10 kHz，偏置电位为
0.6 mmol/L dGTP）中，于 37 ℃下反应 60 min 以扩 0.224 V，幅值为 5 mV。CV 测试在含有 1 mmol/L
H 2 O 2 的 10 mmol/L HEPES 缓冲液中进行，在扫描速
增出连续的 G-四链体序列。最后将 Hemin 引入金电
率为 100 mV/s 下记录测定结果。
极表面，并记录电化学信号。
1.5 实际食品样本中 ENR 检测 2 结果与讨论
牛奶中存在大量的脂肪和蛋白质，对目标物检
测干扰较大，因此对牛奶样本进行预处理以去除蛋 2.1 检测原理
白质与脂肪。首先，将 5 mL 牛奶在 10000 r/min 图 1 为基于 TdT 协同 G-四链体核酶信号放大的
（10 ℃）下离心 10 min 以去除上层脂肪；随后，加 ENR 电化学检测方法示意图。

图 1 基于 TdT 协同 G-四链体核酶信号放大的 ENR 电化学检测方法示意图
Fig. 1 Schematic representation of electrochemical method for ENR detection based on collaborative signal amplification by
TdT with G-quadruplex ribozyme

如图 1 所示，设计带有游离 3'-OH 末端的 R-DNA 纳米线，进而催化 TMB 氧化生成 TMB 氧化产物
探针与 ENR 适体序列部分互补杂交形成一段 DNA （oxTMB），产生显著放大的与 ENR 浓度正相关的
双链探针。当 ENR 存在时，ENR 适体特异性识别 电化学信号，从而实现对 ENR 的灵敏检测。
并结合 ENR，导致 DNA 双链探针分离，释放出单 2.2 原理验证
链 R-DNA 探针。释放出的 R-DNA 与预先修饰于电 采用 EIS、CV 和 I-t 考察检测方法的可行性。
极表面的 S-DNA 探针互补杂交，从而在电极表面引 EIS 是一种用于表征电极经过逐步修饰后表面电子
入游离的 3'-OH 末端。随后，利用 TdT 在 3'-OH 末 传递状况的电化学分析手段，不同电极的 EIS 曲线
端扩增延伸，产生连续的 G 四链体序列。最后，引 见图 2A。如图 2A 所示，裸电极的 EIS 谱图呈现出
入 Hemin 与 G-四链体近位杂交形成 G-四链体核酶 一条直线，几乎没有半圆部分；S-DNA 修饰于金电