Page 191 - 《精细化工》2023年第12期
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第 12 期                   张露妍，等: γ-氨基丁酸/L-瓜氨酸增强白果分离蛋白凝胶性                                 ·2733·


            240 g/L 的溶液，并在室温下搅拌 6 h，然后在 4  ℃                   1.2.7   质构测试
            冰箱放置 12 h，确保完全水化，得到蛋白溶液。分                              凝胶样品质构由物性测试仪测试，使用型号为
            别将 GABA、L-Cit 溶解于去离子水中，室温下搅拌                       P/0.5 的探头。测试前、后速率分别为 1 和 5 mm/s，
            1 h，配制成质量浓度为 40 g/L 的 GABA、L-Cit 原                 而测试速率为 2 mm/s，按压距离为 7 mm，触发力
            溶液。将 3 mL 上述蛋白溶液分别与 GABA、L-Cit                     为 5 g [19] ，下压次数为 2 次。
            原溶液按体积比 1∶1 混合，得到 6 mL 混合溶液，                       1.2.8   蛋白浸出性测试
            即白果蛋白质量浓度为 120 g/L，GABA、L-Cit 质量                       蛋白浸出性按照文献[19]的方法并进行了一些
            浓度均为 20 g/L；不加以上两种氨基酸的蛋白溶液                         修改。将 2 g 白果分离蛋白热诱导凝胶分散在 20 mL
            （对照组）与去离子水等体积混合，然后用 1 mol/L                        50 mmol/L 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液（pH 3.0）中，在
            盐酸或 1 mol/L NaOH 将 pH 分别调至 5.0、6.0、7.0。            室温下放置 2 h。随后将样品以 3000 g，离心 10 min。
            所有的混合溶液密封，室温搅拌 1 h，然后 90  ℃水                       离心后用双缩脲法测试上清液蛋白含量。蛋白浸出
            浴加热 30 min。待样品冷却到室温，放入 4  ℃冰箱                      率按式（2）计算：
            放置 12 h，即为热诱导凝胶。                                                          c
                                                                              LE / %   3    100       （2）
            1.2.3   溶解度测试                                                             c 4
                 按照文献[17]的方法测量蛋白溶解度。将 1.2.2                    式中：LE 为蛋白浸出率，%；c 3 为离心后上清液中
            节中 pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0 的样品用同等对应的                  的蛋白含量，g/L；c 4 为离心前蛋白含量，g/L。
            pH、50 mmol/L 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液稀释至蛋白                       1.2.9   聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测试
            质量浓度为 2.0 g/L，然后在室温下以 5000 g 离心                        将离心后的浸出液与等体积样品缓冲液（含体
            10 min。离心后，使用双缩脲法测量得到的上清液                          积分数为 5% βME）混合，然后煮沸 3 min。不加 βME
            的蛋白含量。溶解度按式（1）计算：                                  的样品加入质量浓度为 0.125 g/L  NEM 以防止蛋白
                                    c                          样品在加热过程中形成二硫键。根据 LAEMMLI                   [20]
                            SD / %   1    100       （1）
                                    c 2                        的方法，采用质量浓度为 50 g/L 浓缩胶和质量浓度
            式中：SD 为溶解度，%；c 1 为离心后上清液中的蛋                        为 125 g/L 分离胶。样品的上样量为 15 μL，每块浓
            白含量，g/L；c 2 为离心前蛋白含量，g/L。                          缩胶和分离胶中电泳的恒定电流分别为 20 和 40
            1.2.4   疏水性测试                                      mA。凝胶使用考马斯亮蓝 R250 染色 3 h，并用体
                 表面疏水性测试按照文献[18]的方法并进行了                        积分数 7.5%乙酸和体积分数 10%甲醇的脱色液褪
            一些修改。将每种蛋白溶液分别用对应相同 pH 的                           至无色。
            50 mmol/L 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液稀释至质量浓度                        1.2.10  FTIR 测试
            为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。稀释后，取 2 mL                   分别取约 1 mg 真空冷冻干燥 48 h（冷井温度
            与 20  μL 质量浓度为 0.025 g/L 的 ANS 混合，避光               –55 ℃）的干制蛋白凝胶样品与 100 mg 左右的溴化
            反应 15 min。使用多功能酶标仪将激发波长和发射                         钾混合并在玛瑙研钵中研磨成细腻的粉末。将研磨
            波长分别设置为 365 和 484 nm，测量不同蛋白溶液                      后的粉末放入磨具中压片，然后进行 FTIR 测试，
            的荧光强度。以蛋白系列质量浓度（g/L）为横坐标，                          波数范围 4000~400 cm 。
                                                                                   –1
            每个蛋白质量浓度对应的荧光强度为纵坐标，拟合                             1.2.11   微观结构测试
            荧光强度与蛋白质量浓度呈线性关系（相关系数均                                 将凝胶样品切成小块（约为 2 mm × 2 mm）固
            为 0.99 以上），其直线斜率即为蛋白疏水性指数。                         定在铜板上，预干燥后再进行喷金处理，用环境扫
            1.2.5   粒径和 ζ-电位测试                                 描电子显微镜观察其微观结构，放大倍数为 5000。
                 将蛋白溶液用对应相同 pH 的 50 mmol/L 柠檬                  1.3   数据处理
            酸盐磷酸盐缓冲液稀释至质量浓度为 2 g/L，以避免                             所有测量重复 3 次，数据以“平均值和标准差”
            多重散射效应       [14] 。使用纳米粒度电位仪测试粒径和                  表示。统计分析使用 Statistix 9.0（分析软件，美国
            ζ-电位。                                              佛罗里达州塔拉哈西）进行。显著性水平 α 设为
            1.2.6   荧光测试                                       0.05。不同的字母表示显著差异。
                 采用多功能酶标仪测试蛋白样品荧光强度。测
            试之前用对应相同 pH 的 50 mmol/L 柠檬酸盐磷酸                     2   结果与讨论
            盐缓冲液将蛋白溶液稀释至质量浓度为 1 g/L，设置
                                                               2.1   GABA、L-Cit 对白果分离蛋白溶解度的影响
            激发波长为 295 nm，使用多功能酶标仪以 1 nm/s
            的扫描速率，测试 320~400 nm 之间的荧光强度                [16] 。      考察了 GABA、L-Cit 对白果分离蛋白溶解度的
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