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第 2 期 赵 鹏，等: 混合磷酸盐法制备款冬花磷酸酯多糖 ·245·

1.2.4 抗氧化能力的测试 混合磷酸盐与款冬花多糖质量比值为 1，尿素为反
1.2.4.1 清除 DPPH•实验 应物总质量的 10%，于 60 ℃反应 5 h，考察磷酸二
按照参考文献[20]方法，进行清除 DPPH•实验。 氢钠与磷酸氢二钠的质量比对取代度的影响，结果
配制不同质量浓度的款冬花多糖溶液、款冬花磷酸 见图 1。
–4
酯多糖溶液，分别加入 4 mL 2×10 mol/L DPPH•溶
液作为样品组；不加 DPPH•的多糖溶液作为对照组；
配制 4 mL 体积分数为 60%乙醇溶液，再加入 4 mL
–4
2×10 mol/L DPPH•溶液作为空白组，用可见光分光
光度计在 λ = 517 nm 处测定吸光度 A，用下式计算
DPPH•清除率。
DPPH•清除率/%=[1－(A 样品A 对照)/A 空白]×100 （4）
式中：A 空白为空白组吸光度；A 样品为样品组吸光度；
A 对照为对照组吸光度。
1.2.4.2 清除超氧根负离子实验

依据参考文献[20]方法，采用邻苯三酚自氧化 图 1 磷酸二氢钠与磷酸氢二钠质量比对取代度的影响
法，其中样品多糖溶液和邻苯三酚溶液在 50 mmol/L Fig. 1 Effect of mass ratio of sodium dihydrogen phosphate
to disodium hydrogen phosphate on the DS
Tris-HCl（pH=8.2）缓冲液保温 20 min 后加入，并

快速摇匀，然后以 Tris-HCl 缓冲液作空白对照，测 从图 1 可看出，当 m（磷酸二氢钠）∶m（磷
定样品在 320 nm 处的吸光度值，每隔 30 s 记录一 酸氢二钠）=2∶1 时，此时得到的款冬花磷酸酯多
次，连续记录 4 min。 糖的取代度最高，继续增加质量比，取代度基本没
–
各管的氧化速率及对 O 2 •的清除率按下式计算： 有变化，因此，确定 m（磷酸二氢钠）∶m（磷酸
V=(A 1 A 0 )/4 （5） 氢二钠）=2∶1。
–1
式中：V 为氧化速率，min ；A 0 为初始吸光度值； 2.1.2 混合磷酸盐与款冬花多糖质量比对取代度的
A 1 为终止吸光度值；4 表示测试时间为 4 min。 影响
清除率/%= (V 自V 样品)/V 自×100 （6） 在 m（磷酸二氢钠）∶m（磷酸氢二钠）=2∶1，
–1
式中：V 自为不加多糖样品氧化速率，min ；V 样品为 尿素为反应物总质量的 10%，于 60 ℃反应 5 h，考
–1
加多糖样品氧化速率，min 。 察混合磷酸盐与款冬花多糖质量比对取代度的影
1.2.4.3 清除羟自由基实验 响，结果见图 2。
依据文献[20]方法，取 5 mmol/L 邻二氮菲溶液，
加 pH=7.4、50 mmol/L 的磷酸缓冲液 2.0 mL 充分混
匀后，加 7.5 mmol/L FeSO 4 溶液 1.0 mL，立即混匀，
加入质量分数为 0.1% H 2 O 2 1.0 mL，最后以 H 2 O 补
充至总体积为 10 mL。37 ℃保温 1 h，在 536 nm 处
测吸光度值 A 损伤。依上述方法，分别加入不同质量
浓度多糖溶液后再加 H 2 O 2 ，然后加入 2 mmol EDTA
在 37 ℃保温 1 h，测 A 样品。未损伤管不加 H 2 O 2 及多
糖溶液测 A 未损伤。
•OH 清除率/% =[(A 样品A 损伤)/(A 未损伤A 损伤)]×100（7）

式中：A 样品为样品组吸光度；A 损伤为损伤组吸光度； 图 2 混合磷酸盐与款冬花多糖质量比对取代度的影响
A 未损伤为未损伤组吸光度。 Fig. 2 Effect of mass ratio of mixed phosphate to
polysaccharides on the DS
2 结果与讨论
从图 2 可看出，随着混合磷酸盐与款冬花多糖
2.1 单因素实验 质量比的增加，款冬花多糖磷酸酯化的取代度快速
2.1.1 磷酸二氢钠与磷酸氢二钠质量比对取代度的 增加，这说明较大的质量比有利于多糖接触到更多
影响 的混合磷酸盐，有利于反应的进行。当 m（混合磷
称取款冬花多糖 0.1 g 加入 10 mL 去离子水， 酸盐）∶m（款冬花多糖）=1.5∶1 时，款冬花磷酸