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第 4 期 薛宏坤，等: 黑加仑花色苷的分离纯化及其热降解动力学 ·723·

为 1.5 mL/min，按照 10 mL/管连续收集不同时间段 为黑加仑花色苷初始质量浓度，g/L。
的洗脱液，依据洗脱液吸光度的大小，将收集后的 1.2.6 黑加仑花色苷热降解动力学模型
[9]
洗脱液经减压浓缩干燥，可获得 2 种黑加仑花色苷 采用试错法 构建温度为 50~90 ℃，间隔为
粉末，分别为 A 3 和 A 4 。 10 ℃，处理时间为 0~4 h，间隔为 1 h 的降解动力学
1.2.2 黑加仑花色苷结构鉴定 模型。其原理如下：假设反应级数为零级、一级、
样品处理：将黑加仑花色苷浓缩液、A 3 和 A 4 ， 二级，则反应物质量浓度ρ与时间 t、ln/ 0 与时间
分别用体积分数 0.1% HCl-甲醇溶液稀释后，配制成 t、1/与时间 t 均呈线性关系，相应线性回归系数最
质量浓度为 0.1 g/L 的样品溶液，溶液过 0.45 μm 滤 高的模型被认为是花色苷热降解动力学模型，其模
[9]
型分别如式（3）~（5）所示 。
膜，用于 HPLC 分析。
   kt （3）
色谱条件： Aglient-1100 C 18 柱（ 150 mm× 0 0
ln    kt （4）
/
4.6 mm，2.6 μm）；流动相 A 为体积分数 5%甲酸水 0 1
溶液，流动相 B 为乙腈-水-甲酸（三者体积比 57.5∶ 1/   1/   kt （5）
2
0
40.0∶2.5）；洗脱程序：0~10 min，5%~20%流动相 式中：k 0 、k 1 、k 2 分别为零级、一级和二级降解速率
常数；t 为加热时间，h。
B，保持 5 min；15~30 min，20%~25%流动相 B，
黑加仑花色苷半衰期 t 1/2 （h）根据式（6）计算 [10] 。
保持 5 min；35~40 min，25%~30%流动相 B，保持
5 min；40~42 min，30%~5%流动相 B，保持 5 min； t 1/2   ln 0.5 / k （6）
活化能可以利用 Arrhenius 方程计算得出，其方
流速为 0.8 mL/min；柱温为 25 ℃；进样量为 25 μL；
程如式（7）所示 [10] 。
检测波长为 520 nm。质谱条件：采用正离子扫描方
ln k  ln A  E / R T （7）
式，质量扫描范围 m/Z 200~2000，毛细管电压 4.5 0 a
5
kV，雾化器压力 1.5×10 Pa，干燥温度 220 ℃。 式中：E a 为活化能，kJ/mol；R 为气体常数；T 为绝
1
对温度，K；A 0 为频率因子，h ；k 为反应速率常
1.2.3 不同 pH 下黑加仑花色苷溶液的热处理
数，mg/(L·min)。
称取一定量样品 A 1 、A 2 、A 3 和 A 4 ，用体积分
1.2.7 黑加仑花色苷抗氧化活性
数 60%乙醇水溶液配制成 1 g/L 的花色苷溶液，用 2
1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力测定
mol/L HCl 和 2 mol/L NaOH 将样品 pH 分别调至 3.0 [11]
参照封燕 等的方法并略作改动。将 A 1 、A 2 、
和 7.0，分装于具塞试管中，每支试管中样品量均为
A 3 和 A 4 配制成质量浓度为 2、4、6、8、10、12、
20 mL，分别放置于 50、60、70、80、90 ℃的恒温
20 和 30 mg/L 的样品溶液，分别取出 2 mL 置于
水浴锅中，避光加热 4 h，依据紫外分光光度法测定
10 mL 比色管中，然后分别加入 2.8 mL 浓度为 0.1
每隔 1 h 样品中花色苷含量变化，每组实验重复 3 mmol/L DPPH 溶液并将其充分混合，避光室温下放
次，取平均值。 置 30 min，在 517 nm 处分别测定其吸光值，以同样
1.2.4 黑加仑总花色苷的测定 的方法测定相同质量浓度 V C 对 DPPH 自由基清除能
[8]
参考于泽源 的方法测定不同实验条件下所得 力，按照式（8）计算 DPPH 自由基的清除率。
提取液中总花色苷的含量。样品中花色苷的质量浓 DPPH自由基清除率 / %  A  （ c A s / A  ） c 100 （8）
度由式（1）计算得出。 式中：A c 为对照品吸光度；A s 为样品溶液吸光度值。
[(A 516  A 700 )pH 1.0  (A 516  A 700 )pH 4.5 ] 449.2 1000  下同。
   f （1）
26900 l 1.2.7.2 ABTS 自由基清除能力测定
+
式中：ρ为花色苷质量浓度，g/L；pH 1.0 和 pH 4.5 为样 [12]
参照李楠 等的方法并稍作修改。将 A 1 、A 2 、
品溶液的 pH 为 1.0 和 4.5；A 516 和 A 700 为样品在 516 A 3 和 A 4 配制成质量浓度为 30、50、80、100、120、
和 700 nm 处的吸光度；f 为稀释倍数；449.2 为矢车 160、200 mg/L 样品溶液，分别取出 0.4 mL 置于
菊素-3-葡萄糖苷标准品的相对分子质量；26900 为矢 10 mL 比色管中，然后加入 4 mL 浓度为 7.0 mmol/L
车菊素-3-葡萄糖苷标准品的消光系数，L/(molcm)； ABTS 工作液，避光室温下放置 10 min，在 734 nm
+
l 为比色皿光程，cm。 处分别测定其吸光值。以相同质量浓度 V C 代替样品
1.2.5 黑加仑总花色苷残留率测定 作对照，按照式（9）计算 ABTS 自由基的清除率。
+
计算不同 pH、温度和时间下样品花色苷残留 ABTS 自由基清除率 / %  A  （ A / A  ） 100 （9）

c s c
率，将式（1）中的ρ带入到式（2）中可以得到花
1.3 数据处理
色苷残留率。
采用 SPSS 22.0 软件对每一组实验数据进行方
残留率 / %   t /  0  100 （2） 差分析（ANOVA）；利用 SAS8.0 软件分析结果的显
式中：  为 t 时刻黑加仑花色苷质量浓度，g/L；  0 著差异；用 Origin 9.0 进行绘图和数据拟合。
t