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第 4 期                     薛宏坤,等:  黑加仑花色苷的分离纯化及其热降解动力学                                    ·723·


            为 1.5 mL/min,按照 10 mL/管连续收集不同时间段                   为黑加仑花色苷初始质量浓度,g/L。
            的洗脱液,依据洗脱液吸光度的大小,将收集后的                             1.2.6    黑加仑花色苷热降解动力学模型
                                                                              [9]
            洗脱液经减压浓缩干燥,可获得 2 种黑加仑花色苷                               采用试错法 构建温度为 50~90  ℃,间隔为
            粉末,分别为 A 3 和 A 4 。                                 10 ℃,处理时间为 0~4 h,间隔为 1 h 的降解动力学
            1.2.2    黑加仑花色苷结构鉴定                                模型。其原理如下:假设反应级数为零级、一级、
                 样品处理:将黑加仑花色苷浓缩液、A 3 和 A 4 ,                   二级,则反应物质量浓度ρ与时间 t、ln/ 0 与时间
            分别用体积分数 0.1% HCl-甲醇溶液稀释后,配制成                       t、1/与时间 t 均呈线性关系,相应线性回归系数最
            质量浓度为 0.1 g/L 的样品溶液,溶液过 0.45 μm 滤                  高的模型被认为是花色苷热降解动力学模型,其模
                                                                                         [9]
                                                               型分别如式(3)~(5)所示 。
            膜,用于 HPLC 分析。
                                                                                    kt             (3)
                 色谱条件: Aglient-1100  C 18 柱( 150  mm×                                0    0
                                                                                ln    kt            (4)
                                                                                   /
            4.6 mm,2.6 μm);流动相 A 为体积分数 5%甲酸水                                         0    1
            溶液,流动相 B 为乙腈-水-甲酸(三者体积比 57.5∶                                      1/   1/    kt        (5)
                                                                                           2
                                                                                       0
            40.0∶2.5);洗脱程序:0~10 min,5%~20%流动相                  式中:k 0 、k 1 、k 2 分别为零级、一级和二级降解速率
                                                               常数;t 为加热时间,h。
            B,保持 5  min;15~30  min,20%~25%流动相 B,
                                                                   黑加仑花色苷半衰期 t 1/2 (h)根据式(6)计算            [10] 。
            保持 5 min;35~40 min,25%~30%流动相 B,保持
            5 min;40~42 min,30%~5%流动相 B,保持 5 min;                              t 1/2     ln 0.5 / k    (6)
                                                                   活化能可以利用 Arrhenius 方程计算得出,其方
            流速为 0.8 mL/min;柱温为 25  ℃;进样量为 25 μL;
                                                               程如式(7)所示       [10] 。
            检测波长为 520 nm。质谱条件:采用正离子扫描方
                                                                             ln k  ln A   E  / R T     (7)
            式,质量扫描范围 m/Z  200~2000,毛细管电压 4.5                                         0   a
                                  5
            kV,雾化器压力 1.5×10  Pa,干燥温度 220  ℃。                   式中:E a 为活化能,kJ/mol;R 为气体常数;T 为绝
                                                                                           1
                                                               对温度,K;A 0 为频率因子,h ;k 为反应速率常
            1.2.3    不同 pH 下黑加仑花色苷溶液的热处理
                                                               数,mg/(L·min)。
                 称取一定量样品 A 1 、A 2 、A 3 和 A 4 ,用体积分
                                                               1.2.7    黑加仑花色苷抗氧化活性
            数 60%乙醇水溶液配制成 1 g/L 的花色苷溶液,用 2
                                                               1.2.7.1    DPPH 自由基清除能力测定
            mol/L HCl 和 2 mol/L NaOH 将样品 pH 分别调至 3.0                       [11]
                                                                   参照封燕      等的方法并略作改动。将 A 1 、A 2 、
            和 7.0,分装于具塞试管中,每支试管中样品量均为
                                                               A 3 和 A 4 配制成质量浓度为 2、4、6、8、10、12、
            20 mL,分别放置于 50、60、70、80、90  ℃的恒温
                                                               20  和 30  mg/L 的样品溶液,分别取出 2  mL 置于
            水浴锅中,避光加热 4 h,依据紫外分光光度法测定
                                                               10 mL 比色管中,然后分别加入 2.8  mL 浓度为 0.1
            每隔 1  h 样品中花色苷含量变化,每组实验重复 3                        mmol/L DPPH 溶液并将其充分混合,避光室温下放
            次,取平均值。                                            置 30 min,在 517 nm 处分别测定其吸光值,以同样
            1.2.4    黑加仑总花色苷的测定                                的方法测定相同质量浓度 V C 对 DPPH 自由基清除能
                           [8]
                 参考于泽源 的方法测定不同实验条件下所得                          力,按照式(8)计算 DPPH 自由基的清除率。
            提取液中总花色苷的含量。样品中花色苷的质量浓                                 DPPH自由基清除率        / %   A  (  c  A s  / A  )  c  100 (8)
            度由式(1)计算得出。                                        式中:A c 为对照品吸光度;A s 为样品溶液吸光度值。
               [(A 516    A 700  )pH 1.0    (A 516    A 700 )pH 4.5 ] 449.2 1000    下同。
                                                     f (1)
                               26900 l                        1.2.7.2    ABTS 自由基清除能力测定
                                                                            +
            式中:ρ为花色苷质量浓度,g/L;pH 1.0 和 pH 4.5 为样                            [12]
                                                                   参照李楠      等的方法并稍作修改。将 A 1 、A 2 、
            品溶液的 pH 为 1.0 和 4.5;A 516 和 A 700 为样品在 516         A 3 和 A 4 配制成质量浓度为 30、50、80、100、120、
            和 700 nm 处的吸光度;f 为稀释倍数;449.2 为矢车                   160、200  mg/L 样品溶液,分别取出 0.4  mL 置于
            菊素-3-葡萄糖苷标准品的相对分子质量;26900 为矢                       10 mL 比色管中,然后加入 4 mL 浓度为 7.0 mmol/L
            车菊素-3-葡萄糖苷标准品的消光系数,L/(molcm);                     ABTS 工作液,避光室温下放置 10 min,在 734 nm
                                                                    +
            l 为比色皿光程,cm。                                       处分别测定其吸光值。以相同质量浓度 V C 代替样品
            1.2.5    黑加仑总花色苷残留率测定                              作对照,按照式(9)计算 ABTS 自由基的清除率。
                                                                                            +
                 计算不同 pH、温度和时间下样品花色苷残留                           ABTS 自由基清除率       / %   A  (  A  / A  )  100 (9)
                                                                      
                                                                                          c  s   c
            率,将式(1)中的ρ带入到式(2)中可以得到花
                                                               1.3   数据处理
            色苷残留率。
                                                                   采用 SPSS  22.0 软件对每一组实验数据进行方
                         残留率   / %     t  /   0   100     (2)   差分析(ANOVA);利用 SAS8.0 软件分析结果的显
            式中:  为 t 时刻黑加仑花色苷质量浓度,g/L;                 0     著差异;用 Origin 9.0 进行绘图和数据拟合。
                    t
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