Page 64 - 201907
P. 64

·1310·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

            1.2.5    CS-LMP 的微观结构                              为反应 60 min 后溶液的吸光值，B 为样品空白的吸
                 CS-LMP 的表面结构通过扫描电子显微镜（SEM）                    光值。
            来观察，将少量冻干后的样品固定在碳样品架上，                                 ABTS 自由基清除率       [15] ：取 7 mmol/L 的 ABTS
            在 3 kV 的加速电压下放大 2000 倍进行观察。                        水溶液与 2.45 mmol/L 的过硫酸钾溶液等体积混合，
            1.2.6    负载槲皮素的纳米复合物（CS-Q-LMP）的制备                  避光反应 12 h 以上。实验前用甲醇将 ABTS 储备液
                 参考 Cho 等  [13] 的方法并作修改，将一定量的槲                 稀释至 734  nm 处吸光值为 0.7±0.02。取 100  μL 样
            皮素溶于无水乙醇中，配制成 1 g/L 的槲皮素溶液，                        品溶液加入到 2 mL ABTS 溶液中，振荡 20 s，反应
            取 10  μL 槲皮素溶液加到复合物溶液中，使槲皮素                        6 min，在 734  nm 波长处测定其吸光值，自由基清
                            –5
            的浓度为 3.3110  mol/L，乙醇的体积分数为 1%，                   除率公式同式（3）。
            为了测定其包埋率（Encapsulation efficiency，EE），             1.2.10    CS-Q-LMP 的热稳定性
            将溶液在 4  ℃，4000 r/min 下离心 30 min，除去上                    进行热稳定性测试时，转移 10 mL 复合物样品
            清液，将沉淀的未溶解的槲皮素重新溶于无水乙醇                             至玻璃离心管中，然后分别在 60  ℃（巴氏杀菌）、
            中，用槲皮素标准品作标准曲线，计算剩余槲皮素                             90  ℃（煮沸）下加热一段时间           [16] ，每隔一段时间取
            含量。                                                1 mL 溶液测定其粒径（D z ）、PDI 和 Zeta 电位，观
                           EE/%=(1W 1 /W 0 )100     （1）      察其这些指标的变化，每个样品重复 3 次测定。
            式中：W 0 是槲皮素的初始质量，μg；W 1 是剩余槲                       1.3   数据处理
            皮素质量，μg。                                               所得数据使用 Origin  8.0 绘制相关图表。D z 、
            1.2.7    槲皮素与 CS 的结合机理                             Zeta 电位、PDI 等使用 SPSS20.0 对其进行方差分析
                 参考 Li 等  [14] 方法并稍作修改，槲皮素与酪蛋白                 （ANOVA），且利用邓肯式多重比较对差异显著性
            的结合机理将通过荧光光谱（Fluorescencespectra）                  进行分析（P<0.05：具有显著性差异），图中字母完
            来解释。槲皮素的质量浓度分别为 0、0.5、1、2、4、                       全不同的两组数据具有显著性差异。每次测试前需
            6、8 g/L。将 0.1 mL 槲皮素乙醇溶液加入到 10 mL                  更换样品，且每组实验均重复 3 次。
            酪蛋白溶液（质量分数 0.1%）中，磁力搅拌 10 min。
            然后取 3 mL 搅拌后的溶液进行荧光测定。荧光光谱                         2    结果与讨论
            在 290  nm 处激发，扫描波长为 300~450  nm，激发
                                                               2.1   复合物浓度对 CS-LMP 纳米复合物透光度的
            和发射狭缝宽度分别为 5 和 10 nm，电压为 500 mV。
                                                                   影响
            利用 Stern-Volmer 方程来分析蛋白质与槲皮素的结
                                                                   蛋白质和多糖的浓度会影响复合物所带的电荷
            合常数（K b ）和结合位点数（N）如下式：
                                                               数量，进而影响复合物的稳定性。CS 的 pI 在 4.7
                        l  g  [  F 0 –F]/F=lgK b +Nlg [Q]   （2）
                                                               左右，溶液的 pH 在 pI 处，CS 会失去电荷，发生聚
            其中：K b 为蛋白质与猝灭剂之间相互作用的猝灭常
            数；N 为蛋白质与猝灭剂之间的结合位点数；F 0 为 Q                       集。通过测定溶液透光度的变化来评估溶液的稳定
                                                               性，结果见图 1。从图 1 可知，在 LMP 质量分数较
            浓度为 0  mol/L 时的最大荧光强度；F 为有 Q 存在
            时各溶液的最大荧光强度；[Q]为槲皮素的浓度 mol/L。                      低（不为 0）时，溶液透光度较低，这可能是因为
            1.2.8    槲皮素及 CS-Q-LMP 的紫外可见吸收光谱和                  LMP 含量太少，不足以覆盖所有的 CS，在溶液的
                   FTIR 分析                                     pH 接近等电点时，CS 失去电荷，发生沉降，当果
                 取 1.2.6 中的槲皮素溶液、CS-Q-LMP 复合物溶                 胶浓度继续升高，溶液透光度升高。CS 质量分数为
            液各 3 mL 于石英皿中，于波长 300~600 nm 处进行                   0.05%时的溶液透光度高于其他浓度的透光度，考虑
            光谱扫描，得到光谱曲线，进行分析。采用溴化钾压                            到应用 CS 包埋槲皮素，其浓度不宜过低                [10] ，所以，
                                                        –1
            片法进行红外光谱测定，扫描波长为 500~4000 cm 。                     选择质量浓度 1.0 g/L CS、质量浓度 2.0 g/L LMP 溶
            1.2.9    抗氧化能力的分析                                  液，溶液的透光度为 0.81。
                 参考刘夫国等      [15] 方法，并作适当修改。DPPH               2.2    pH 对 CS-LMP 纳米复合物稳定性影响
                                                 4
            自由基清除率：用无水乙醇配制 1.7510  mol/L 的                        不同 pH 下，CS、LMP 及复合物的 pH 和 Zeta
            DPPH 溶液，取 100 μL 样品溶液加入到 2 mL DPPH                 电位如图 2 所示，图中百分数表示质量分数。由图
            乙醇溶液中，室温避光反应 1  h，随后检测其在                           2 可知，当 CS 溶液 pH 为 2.0~4.0，其带正电荷，Zeta
            517 nm 处的吸光值，每个样品重复 3 次测定。                         电位为正值；当溶液 pH=4.0~5.0，CS 溶液的 Zeta
                 自由基清除率/%=[A 1 (A t B)]/A 1 100    （3）      电位由正值变为负值。Anal 等           [17] 研究表明，CS 的
            式中：A 1 为 DPPH 或 ABTS 空白对照的吸光值，A t                  等电点为 4.7。LMP 是一种阴离子多糖，其本身带负
   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69