Page 155 - 精细化工2019年第9期

第 9 期 薛宏坤，等: 蓝莓果渣花色苷提取工艺优化及其提取物的抗肿瘤活性 ·1883·

1.2.3 UAE 法提取 BP 中花色苷工艺优化 再利用 150 mL 体积分数 5%甲醇洗脱目标物质，收
单因素实验：以 2.00000.0005 g BP 样品为对 集洗脱液，经 0.22 m 滤膜，滤液为待测液备用。
象，体积分数 60%乙醇为提取溶剂，本实验设定超 标准品准备：分别精确称取 6 种蓝莓花色苷标
声功率 80、160、240*、320、400 W 5 个水平；超 准品(飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、
声时间 4、6、8*、10 和 12 min 5 个水平；料液比 1∶ 矢车菊素-3-芸香糖苷、牵牛花素-3-葡萄糖苷、锦葵
10、1∶20、1∶30*、1∶40 和 1∶50 g/mL 5 个水平， 素-3-半乳糖苷和芍药素-3,5-二己糖苷)1 mg，用体积
考察 3 个因素对 BP 花色苷含量的影响。 分数 1%盐酸-甲醇溶液 1 mL 使其溶解，配制成质量
3
依据单因素实验结果，设计 L 9 (3 )正交实验， 浓度 1 g/L 的母液；分别取适量上述 6 种花色苷，
因素水平编码如表 3 所示。 再用体积分数 1%盐酸-甲醇溶液稀释成不同质量浓
度标准品溶液。以标准品质量浓度 X 为横坐标，峰
3
表 3 UAE 法提取 BP 中花色苷的 L 9 (3 )正交实验因素及
面积 Y 为纵坐标，制作标准曲线。
水平
Table 3 Factors and levels of orthogonal tests for extraction HPLC 条件：Aglient-1260 C 18 柱（150 mm×
of anthocyanins from BP by UAE 4.6 mm×2.6 m）；流动相由乙腈（A）和质量分数
因素 0.1%甲酸水溶液（B）构成，梯度洗脱如下（百分
水平
超声功率/W 超声时间/min 料液比/(g/mL) 数表示体积分数）：0~25 min：0~45% A，100%~55%
1 160 6 1∶20 B；25~42 min：45%~0 A，55%~100% B；流速为 0.8
2 240 8 1∶30
mL/min；柱温为 25 ℃；进样量为 25 L；检测波长
3 320 10 1∶40 为 520 nm。

1.2.4 花色苷含量的测定 质谱条件：正离子模式，扫描范围：50~1000 m/Z；
5
参考于泽源 [13] 等的方法采用 pH 示差法测定样 干燥气压力：2.76×10 Pa；流量：12 L/min；温度：
350 ℃，毛细管电压：3500 V。
品中花色苷含量。花色苷含量（c）用每克样品中含
1.2.6 BP 颗粒微观结构分析
有矢车菊-3-葡萄糖苷（C3G）的质量表示（mg
将未经处理的原样和经 OSE 法、MAE 法、UAE
C3G/g），如式（1）所示：
c  法提取后得到的样品，冷冻干燥后分别均匀地粘在
[(A 520  A 700 )pH 1.0  (A 520  A 700 )pH 4.5 ] M w DF  1000 铝制托盘上，之后在样品表面镀上一层 1500 nm 厚度的
M  金膜，用于 电镜实验。 利用分形维 数（ Fractal
L m
a
（1） dimension, FD）原理定量计算样品细胞壁破裂程度。
式中：c 为样品中花色苷含量，mg C3G/g；A 为样 运用 Image J 软件计算各微观结构 FD，计算式如式
品提取液的吸光值；DF 为稀释倍数；A 520 和 A 700 分 （2）所示 [14] ：
别为样品在 520 和 700 nm 处的吸光值；M w 为矢车 Ir
()
D  lim （2）
菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量（449.2）；M a 为矢车 i r 0 lg(1/ )r

菊素-3-葡萄糖苷的消光系数〔26900 L/(mol·cm〕〕；L 为 式中：r 为盒子尺度；D 为分形维数。
比色皿光程（1 cm）；m 为样品质量，g。 1.2.7 MTT 法测定肿瘤细胞的活力
1.2.5 HPLC-ESI-MS 测定样品花色苷组分 采用 MTT 法测定 3 种提取方式最优参数组合下
样品准备：在 3 种提取方式最优参数组合下获 得到的样品对肿瘤细胞的增殖抑制作用，参照郭孝
得的提取液，于 50 ℃旋转蒸发浓缩，得到 BP 花色 萱等 [15] 的方法，细胞存活率按式（3）计算。
苷粗提液。移取 30 mL 粗提液，注入 AB-8 大孔吸 细胞存活率 /%  A / A  100 （3）
样品， 490 nm 对照，
490 nm
附树脂柱（2.6 cm×60 cm）中充分吸附，进样流速 1.2.8 BP 提取物对 HepG2 肝癌细胞和 A549 肺癌细
为 1 mL/min，进样完全后，依次用 90 mL 酸化的去 胞侵袭能力的影响
离子水（含质量分数 0.01% HCl）、30 mL 体积分数 参考毛岸云等 [16] 的方法，采用 Transwell 侵袭实
30%乙醇溶液（含质量分数 0.01% HCl）和 60 mL 验考察 HepG2 肝癌细胞和 A549 肺癌细胞侵袭能力，
体积分数 95%乙醇溶液（含质量分数 0.01% HCl） 在倒置显微镜下观察，并计算细胞数量，侵袭率的
洗脱，洗脱流速为 1.5 mL/min，收集洗脱液，在 50 ℃ 计算公式如式（4）所示：
减压浓缩，得到 AB-8 大孔吸附树脂纯化后的浓缩 侵袭率/ %  (实验组侵袭细胞数 空白组侵袭细胞数 ) 100 （4）
/
液，将其配制成质量浓度为 0.1 g/L 样品溶液，过 1.2.9 数据处理
0.45 m 滤膜，然后 C 18 固相萃取柱，最后将滤液缓 每组实验重复 3 次，结果用平均值标准差表
慢压过柱子，利用 30 mL 去离子水去除干扰杂质， 示；采用 Statistix 8.0 软件对每组实验数据进行方差