Page 154 - 《精细化工》2020年第5期
P. 154

·1004·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 37 卷

            比 20∶100 混合后放入刚玉坩埚，置于管式电阻炉                         液，放入 CO 2 培养箱中在 37 ℃、5% CO 2 环境中孵
            中，在常压下以 10 ℃/min 的速率升温，升至 1000 ℃                   育 4 h，然后弃去培养基和 MTT，向各孔中加入 150 μL
            后保温 3 h，然后取出坩埚自然降温冷却，得到粉红                          DMSO 以溶解残留的 MTT-甲臜结晶，振荡 10 min，
            色的松盐。                                              以不加样品培养的细胞作为对照，PBS 作为空白。
                 新型梅盐的制备：将梅枝提取物与原盐按质量                          用酶标仪测定各孔在 570 nm 下的吸光值（OD 570 ）。
            比 20∶100 混合后放入刚玉坩埚，置于管式电阻炉                         细胞增殖率按下式计算          [17] ：
            中，在常压下以 10 ℃/min 的速率升温，升至 900 ℃                        细胞增殖率/% =  〔OD 570 （实验）OD 570 （空白） 〕/
            后保温 2 h，然后以 10 ℃/min 的速率升温至 1300 ℃                 〔OD 570 （对照）OD 570 （空白） 〕100
            后停止加热，取出坩埚自然降温冷却，得到蓝色的                             1.2.5    B16 细胞内酪氨酸酶活性的测定
            梅盐。                                                    采用多巴氧化法对 B16 细胞内酪氨酸酶活性进
            1.2.2    新型功能性植物盐溶液 pH 的测定                         行测定   [18] 。将 B16 细胞接入 96 孔板，贴壁后弃去
                 利用纯水分别配制 2.0、10.0 及 50.0 g/L 的植物              原培养基，加入含有各样品的培养基进行培养 48 h。
            盐及原盐、烤盐水溶液，澄清后取上清液，采用酸                             将作用时间已到的各组细胞倾去培养液，用 PBS 缓
            度计进行溶液 pH 的测定。                                     冲液洗 2 次，每孔加入质量分数 1%的 Triton X-100
            1.2.3    体外酪氨酸酶抑制率测定                               水溶液 50 μL，然后迅速放入80 ℃冰箱内冻存 30 min，
                 以酪氨酸作为酪氨酸酶单酚酶活性测定的底                           取出后在 37 ℃下融化，使细胞完全破裂，每孔加入
            物，以 L-DOPA 作为酪氨酸酶二酚酶活性测定的底                         10  μL  L-DOPA 溶液(10  g/L)，以不加样品培养的细
            物，参考 HUANG 等       [16] 的方法进行酪氨酸酶的活性               胞作为对照，PBS 作为空白，37 ℃下反应 2  h，用
            测定。首先，将原盐、烤盐、松盐、竹盐、梅盐用                             酶标仪测定各孔在 475 nm 处的吸光值（OD 475 ）。细
            PBS 溶液配成 2.0、10.0、50.0、100.0 g/L 的盐溶液，             胞内酪氨酸酶活性按下式计算              [18] ：
            按表 1 中反应液 A1、A2、A3、A4 组成依次准确吸                          细胞内酪氨酸酶活性/% =  〔OD 475 （实验）
            取不同浓度的样品溶液、0.1 mol/L pH 6.8 的 PBS 溶                OD 475 （空白） 〕/  〔OD 475 （对照）OD 475 （空白） 〕  100
            液和 1.0 mmol/L 的酪氨酸或 L-DOPA，充分混匀后                   1.2.6    B16 细胞迁移测定
            放入25 ℃水浴锅孵育10 min，然后加入相应的870 U/mg                      选择对数生长期的 B16 细胞，调整细胞浓度至
                                                                    5
            酪氨酸酶溶液，10 min 后测定各反应溶液在 475 nm                     4×10 个/mL，取 2 mL 加入 6 孔板，待细胞在底部
            处的吸光值，OD A1 表示反应液 A1 的吸光值，以此                       覆盖 60%左右时，弃去原培养基，取 10  μL 移液枪
            类推。抑制率按下式计算            [16] ：                      头在每孔底部画直线（一次操作），用 PBS 轻轻洗
                 酪氨酸酶单酚酶或二酚酶抑制率/%=〔1–(OD A3–                   去滑落的细胞，再用 5.0 g/L 的原盐、松盐、竹盐、
            OD A4 )/(OD A1 –OD A2 )〕×100                       梅盐、熊果苷配制的培养基继续培养 48  h，在显微
                                                               镜下观察细胞的生长状态与迁移情况，以不加样品
               表 1    体外酪氨酸酶活测定中的反应液组成（mL）                     培养的细胞作为对照         [19] 。
            Table  1    Composition  of  reaction  solution  in  in vitro  tyrosinase   1.2.7    B16 细胞周期的测定
                    activity assay (mL)
                                                                   在 6 孔板中使 B16 细胞贴壁后，加入含有 5.0 g/L
                  反应液成分           A1     A2    A3     A4
                                                               各试样的培养基进行培养，每组 3 个平行样品并设
                   样品溶液            0     0     0.3    0.3
                                                               置空白对照组，分别培养 48  h。培养结束后收集细
                 PBS 缓冲溶液         0.4    0.5   0.1    0.2
                                                               胞，用 PBS 清洗后去掉上清液，加入冷的体积分数
             底物（酪氨酸/L-DOPA）       0.5    0.5   0.5    0.5
                                                               70%乙醇溶液 500  μL，固定过夜，然后离心并吸取
                   酪氨酸酶           0.1    0     0.1     0
                                                               残留的乙醇。在细胞沉淀中加入 RnaseA 溶液 100
            1.2.4    B16 细胞增殖率的测定                              μL，重悬细胞，37 ℃水浴 30 min，再加入 400 μL PI
                 采用 MTT 法测定 B16 细胞增殖率           [17] 。以原盐      染色液混匀，4 ℃避光孵育 30  min，将单细胞悬液
            为阴性对照，-熊果苷和韩国竹盐作为阳性对照。                            转移至流式管中上机检测，记录激发波长 488 nm 处
            选择对数生长期的 B16 细胞接入 96 孔板，贴壁后弃                       红色荧光。
            去原培养基，加入配好的含有 2.5、5.0、7.5 和 10.0 g/L               1.3   数据处理
            的原盐、松盐、竹盐、梅盐、-熊果苷和韩国竹盐                                采用 Origin9 处理实验数据，计算结果以平均值
            的培养基，在 37 ℃、5% CO 2 条件下培养 48 h。在                   ±标准差（Mean±SD）表示，使用 SPSS 21 单因素
            测定前 4 h 取出，每孔加入 20 μL MTT（5 g/L）溶                  方差分析 ANOVA  中的 Duncan 进行显著性检验。
   149   150   151   152   153   154   155   156   157   158   159