Page 83 - 《精细化工》2020年第8期
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第 8 期                      喻   彪，等: Hf-ZnO 酪氨酸酶生物传感器检测邻苯二酚                              ·1581·


            快速高效、小型化、重复性好和低成本使其成为研                             量分数 99.5%）、多巴胺（DA）、尿素（Urea）、过
                     [6]
            究的热点 。                                             氧化氢（H 2 O 2 ），AR，上海麦克林生化科技有限公
                 酪氨酸酶（Tyr）生物传感器因能快速高效地检                        司；氢氧化钾（KOH）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、
            测邻苯二酚而得到普遍关注。其工作原理是在氧气                             乙二醇、六水合硝酸锌，AR，国药集团化学试剂有
            存在下，固定在特定载体上的酪氨酸酶催化邻苯二                             限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），AR，成
            酚氧化为邻苯二醌，邻苯二醌在电极表面得到电子                             都科龙化工试剂厂；不同 pH 的磷酸盐缓冲溶液
            再次还原成邻苯二酚，过程中会产生与浓度相应的                             （PBS）通过不同比例的 0.1 mol/L 的磷酸氢二钠和
            还原电流信号，从而实现对溶液中邻苯二酚浓度的                             0.1 mol/L 的磷酸二氢钠混合配制而成。
            准确检测     [7-8] 。                                   1.2   仪器设备
                                   [9]
                 近年来，金纳米颗粒 、铂            [10] 、碳纳米管   [11] 等       Hitachi SU8220 场发 射扫描电子显微镜
            材料已成功应用于生物传感器检测邻苯二酚，并取                             （FESEM），日本日立公司；D/max 2500V X 射线衍
            得了很好的效果。但材料昂贵的成本和复杂的制备                             射仪（XRD），日本 Shimadzu 公司；ESCALAB
            过程限制了其在实际中的应用              [12] 。因此，寻找制备           250XI+X 射线光电子能谱仪（XPS），中国赛默飞世
            方法简单且价格低廉的材料制备传感器并达到较好                             尔科技有 限 公司；电 化 学工作站 ， 荷 兰 Ivium
            的检测效果是目前研究的方向。                                     Technologies 公司；D-78532 高速冷冻离心机，德国
                 纳米氧化锌成本低廉、合成技术成熟，且具有大                         Eppendorf 公司；Zetasizer Nano ZSP 纳米粒度分
            的比表面积、高的等电点和好的生物相容性等，是                             析仪，英国马尔文仪器有限公司；玻碳电极（直径
            理想的生物载体        [13] 。但氧化锌应用在生物传感器时，                3 mm）、Ag/AgCl 电极和铂电极，中国高仕睿联科
            其高电阻率限制了其性能的提升。GU 等                 [14] 用纳米氧      技有限公司。
            化锌构建了酪氨酸酶生物传感器，在 20~120 µmol/L                     1.3  Hf-ZnO 的制备
            内实现对邻苯二酚的检测，但传感器灵敏度仅为                                  称取 0.56 g KOH 和 0.2 g CTAB，加水超声分散
            0.83 mA/(mol/L)，难以实现对邻苯二酚的微量检测。                    于 10 mL 去离子水中，然后加入 40 mL 乙二醇混合，
            有研究人员将镓、铟等元素掺杂入氧化锌中，提高                             待混合均匀后加入 10 mL 0.4 mol/L Zn(NO 3 ) 2 •6H 2 O
            了氧化锌的导电性         [15-17] 。相对于稀土金属，Hf 成本            溶液和 10 mL 氯化铪（0、0.0054、0.009、0.018、
            低，且 Hf 和 Zn 同属于过渡金属原子，半径相差不大，                      0.036 mol/L）溶液。将上述溶液搅拌均匀后倒入水
                                               4+
            易掺杂进入 ZnO 晶格中         [16] 。低浓度 Hf 能有效取代           热反应釜中，180  ℃下水热反应 4 h。待溶液冷却后，
                   2+
            部分 Zn 在 ZnO 晶格中的位置，提高氧化锌的结晶                        离心分离得到白色固体，分别用水和乙醇洗涤数次
                                                               后，干燥，得 Hf-ZnO 前驱体。将前驱体在 500  ℃
            度和导电性，进而促进氧化锌传感器中酶和电极之间
            的电子转移，提高传感器的灵敏度               [18] 。目前，Hf 掺杂       马弗炉中煅烧 2 h，得到 Hf 不同掺杂量的白色粉末
            氧化锌材料在生物传感器方向的研究鲜有报道                      [19] 。   状 Hf-ZnO 材料（Hf 质量占 ZnO 质量的百分数分别
                                                               为 0、3%、5%、10%、20%）。
                 本文尝试通过水热法来制备 Hf 掺杂纳米氧化锌
                                                               1.4  Tyr/Hf-ZnO/CS/GCE 工作电极的制备
            材料，壳聚糖（CS）含有丰富的亲水性氨基和羟基，
                                                                   参照文献[8]对电极进行处理，将玻碳电极分别
            具有易成膜性和生物相容性而被用于酶的固定。采
                                                               用粒径为 1.0、0.3 和 0.05 µm 的 Al 2 O 3 浆料抛光打
            用包埋法将酪氨酸酶包裹于壳聚糖和 Hf 掺杂氧化锌
                                                               磨电极表面成镜面状，并依次置于与二次蒸馏水体
            复合物中并固定在玻碳电极表面构建 Tyr/Hf-ZnO/
                                                               积比为 1∶1 的乙醇中、硝酸溶液中超声清洗以去除
            CS/GCE 生物电极，考察其对邻苯二酚的检测能力，
                                                               电极表面弱吸附的 Al 2 O 3 和其他杂质。将打磨电极
            旨在构建一种对邻苯二酚具有高灵敏度、低检测限
                                                               置于 5 mmol/L 的 K 3 Fe(CN) 6 /K 4 Fe(CN) 6 （物质的量
            的酪氨酸酶生物传感器。
                                                               比为 1∶1）溶液中，通过测定循环伏安曲线（CV）
            1   实验部分                                           判断玻碳电极是否清洁干净，若电极 CV 曲线的氧
                                                               化还原峰电位差在 90 mV 以下，则说明清洗干净，
            1.1   试剂和材料                                        冲洗，干燥，备用。
                 酪氨酸酶（菌菇提取，EC1.14.18.1，7164 U/mg），                 取 5 μL 4 g/L 的 Hf-ZnO 水溶液、5 μL 1 g/L 的
            德国 Sigma 公司。壳聚糖（脱乙酰度≥95%），浙江                       Tyr 溶液（0.1 mol/L PBS）和 10 µL CS 水溶液（2 g/L）
            金壳生物化学有限公司。铁氰化钾〔K 3 Fe(CN) 6 〕、                    混合后滴涂到打磨电极上，在 4  ℃下干燥 5 h 得
            亚铁氰化钾〔K 4 Fe(CN) 6 〕、邻苯二酚（Catechol）、               Tyr/Hf-ZnO/CS/GCE 修饰电极，随后保存在 4  ℃，
            葡萄糖（Glucose）、抗坏血酸（AA）、氯化铪（质                        0.1 mol/L 的 PBS 溶液中备用。
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