Page 93 - 《精细化工》2020年第9期

第 9 期 刘庆宇，等: 基于 1,8-萘酰亚胺检测细胞内肼的荧光探针 ·1807·

三氟乙酸丙酮与肼的特异性结合 [20] 以及邻苯二甲酰 谱仪，美国 Agilent 公司；RF5000 型荧光分光光度
亚胺与肼的 Gabriel 合成反应 [21] 等。例如：SHI 等 [9] 仪，日本岛津公司；Zeiss LSM 880 共聚焦显微镜，
设计合成了一种基于香豆素衍生物和乙酸酐的开启 德国 Carl Zeiss 公司。所有光谱均使用光程为 1.0 cm
型荧光探针；LIU 等 [22] 通过结合氯和丙二腈开发了 的标准石英比色皿。
一种检测肼的荧光探针；JUNG 等 [19] 开发了一种基 1.2 合成
于芳醛缩合机理的荧光探针；JIN 等 [23] 设计了一种 化合物Ⅰ的合成：参照文献[27]的实验方法制
以三溴乙酸丙酮作为反应位点的荧光探针；ZHAO 得，收率为 89%。
等 [24] 以丹磺酰氯为荧光母体基于 Gabriel 反应机理 化合物Ⅱ的合成：称取化合物Ⅰ（1.00 g，
合成了一例比色型荧光探针。但是，大多数探针只 2.72 mmol）于 50 mL 圆底烧瓶中，加入吗啡啉（0.26 g，
能在特定的 pH 范围内对肼有着良好的响应。例如： 3.00 mmol）和乙醇（30 mL），加热回流 24 h，然后
LEE 等 [25] 开发了一种在酸性条件下检测肼的探针 将反应混合物在室温下冷却过夜。过滤晶体，得到
（探针在 pH 2~5 的范围内对肼具有良好的响应）； Ⅱ（0.56 g，收率为 55%）。 HNMR(400 MHz, CDCl 3),
1
QU 等 [26] 设计了一种以香豆素作为荧光母体，在 pH δ: 7.99 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.0 Hz, 1H),
为 6~9 时具有良好响应的探针。因此，开发一种能 7.63 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.50 (m, 2H), 7.41 (dd, J 1 =
8.56 Hz, J 2 = 7.81 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.3 Hz, 1H),
在大的 pH 范围内稳定检测肼的荧光探针是非常重
6.68 (m, 2H), 5.35 (s, 1H), 3.75 (m, 4H), 3.29 (m, 4H)。
要的。
化合物Ⅲ的合成：参照文献[28]的实验方法制
基于上述原因，本文设计合成了荧光探针 NH1，
得，收率为 80%。
并且在验证探针分子结构的基础上，对其进行体外
化合物 NH1 的合成：称取化合物Ⅱ（0.37 g，
光谱测试和细胞内成像实验，并考察了探针对肼的
1.00 mmol）和化合物Ⅲ（0.29 g，1.20 mmol）于圆
检测效果，合成路线如下所示。
底烧瓶中，加入 10 mL 四氢呋喃搅拌溶解，然后滴
入三乙胺（10 mL），在 50 ℃下搅拌 3 h，反应完成
后，将粗产物通过柱色谱纯化〔溶剂为 V（二氯甲
烷）∶V（甲醇）=20∶1〕，获得 NH1（0.46 g，收
1
率为 79%）。 HNMR(400 MHz, CDCl 3 ), δ：8.65 (d,
J =6.4 Hz, 1H), 8.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.49 (, d, J =
8.5 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.76 (t, J =
7.9 Hz, 2H), 7.54 (dd, J 1 = 12.8, J 2 = 7.9, 2H), 7.36 (d,
J = 3.3 Hz, 3H), 7.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.29 (d, J =
2.1 Hz, 1H), 6.66 (d, J =16.0 Hz, 2H), 3.96~4.12 (m,
4H), 3.19~3.37 (m, 4H); HRMS (ESI), m/Z:
+
C 31 H 23 BrN 2 O 5 [M+H ] 理论值 585.4382, 实测值：
585.4372。
1.3 NH1 的光谱性能测试
室温下，将探针溶解于二甲基亚砜中制成浓度
为 1 mmol/L 的母液。进行光谱测量时，测试体系为
乙醇与 PBS 的混合溶液〔20 mmol/L，V（乙醇）∶
V（PBS）=1∶1, pH=7.4〕，室温下在 1.0 cm 的石英
比色皿中将探针 NH1 稀释为 10 μmol/L。用紫外光

谱仪和荧光分光光度仪测试探针的光谱性能。测试
1 实验部分 条件：紫外光谱仪扫描范围 350~ 550 nm，荧光分光
光度仪激发波长设置为 λ ex = 397 nm，扫描波长范围
1.1 试剂与仪器 为 450~700 nm，狭缝宽度为 5.0 nm。
所有化学药品和溶剂均为市售分析纯试剂，无 1.4 细胞中肼的测试
需进一步纯化即可使用。所使用蒸馏水经过超纯化 首先，将探针 NH1（10 μmol/L）与一组细胞在
系统处理。 37 ℃下共同孵育 30 min，然后用 PBS（20 mmol/L）
Mercury Plus 400 核磁共振波谱仪，美国 Varian 清洗 3 次进行生物成像。接下来，将另一组细胞与
公司；Agilent 1200 液相色谱仪、HP-8453 型紫外光 NH1（100 μmol/L）共同培养 30 min，再用肼处理