Page 122 - 《精细化工》2021年第5期

·976· 精细化工 FINE CHEMICALS
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孔细胞浓度为 1×10 个/L，按每孔 100 µL 接种于 96
孔板中，培养 24 h 后，加入含不同质量浓度的 NEPP
和质量浓度 1 mg/L LPS 的完全培养基 200 µL，设置
5~7 个质量浓度梯度，以不含样品的培养基作为空
白对照，每个质量浓度均设置 5 个重复孔，于 37 ℃
细胞培养箱中孵育 24 h 后，弃去上清，加入体积分
数 0.05%的中性红溶液进行染色，1 h 后吸出染色液，
用 PBS 清洗 3 次，每孔加入 150 μL 细胞裂解液，
振荡混匀 15 min，测定其在波长 550 nm 下的吸光
度。细胞对中性红吞噬能力用吞噬指数（PI）表示。
A
PI / %  s  100
A l
式中：A s —实验组吸光度（含细胞、培养基、样品）；
A l —LPS 组吸光度（含细胞、LPS、培养基）。
1.3 数据分析
采用 Origin 软件对单因素实验数据进行分析，
采用 Expert-Design 8.0 统计软件进行响应面优化分
析，用 SPSS 17.0 软件对数据进行 ANVOA（Analysis
of variance）分析和差异性比较，当 p<0.05 时差异
显著，实验结果均用平均值±标准差表示。
2 结果与讨论
2.1 金柑 NEPP 提取单因素实验
以 NEPP 含量为参考指标，比较不同提取条件
下的提取效果，结果见图 1。
第 38 卷
图 1 脉冲数（a）、液料比（b）和场强（c）对金柑 NEPP
（2） 含量的影响
Fig. 1 Effects of pulse number (a), liquid-solid ratio (b)
and field strength (c) on NEPP content of Kumquat
由图 1a 可知，当脉冲数为 250 次时，金柑 NEPP
含量达到最大值 1.55 mg GAE/g DW；随着脉冲数的
增加，NEPP 含量略有降低并趋于平稳，与脉冲数
低于 250 次的 NEPP 含量相比有所增加。由图 1b 可
知，随着液料比不断降低，NEPP 含量先增加后减
少，当液料比为 0.3∶1 时，NEPP 含量达到最大值
1.62 mg GAE/g DW。由图 1c 所示，随场强的增加，
NEPP 含量先增加后减少，最大值为 1.60 mg GAE/g
DW。由于脉冲次数过多、场强过大，有可能将物质
本身的一些化学成分破坏，使 NEPP 含量降低；另
一方面随着溶剂的减少，被释放的部分 NEPP 无法
充分溶解，也可能导致所测得的 NEPP 含量减少。
根据单因素实验的结果，设置响应面实验的优化条
件为：脉冲电场场强 8、10、12 kV/cm，脉冲数 250、
350、450 次，液料比 0.50∶1、0.38∶1、0.25∶1（根
据单因素实验结果，选取响应面实验条件，其中 10
kV/cm、350 次、0.38∶1 这 3 个实验条件为每组实
验条件的平均值，由软件自动生成）。
2.2 金柑 NEPP 提取响应面法优化
2.2.1 脉冲电场回归模型的建立与方差分析
根据 1.2.4 节设计，得到实验结果见表 2 和表 3。
金柑 NEPP 提取影响因素（非编码方程）回归
方程为：
Y=–1.63+0.067X 1 +0.28X 2 +0.17X 3 –0.039X 1 X 2 +
2
2
0.12X 1 X 3 +0.053X 2 X 3 –0.12X 1 –0.13X 2 –
2
0.39X 3 （3）
式中：X 1 为脉冲数；X 2 为场强；X 3 为液料比；Y 为
NEPP 含量。
由表 2 可知，不同的因素条件进行组合得到 17
种实验条件，在脉冲数、场强、液料比的协同作用
下，通过响应面分析软件进行金柑 NEPP 提取条件
的优化。其中，实验号 3、10、14 条件相同的情况
为软件自动生成，均为独立实验组，NEPP 含量会